在所有抗体相关实验当中，如果说免疫印迹（WB）是最朴素无华的，那免疫荧光（IF）一定是最绚烂夺目的那个！
IF数据一拿出来，老板都舍不得在组会上批评你！
“道理我们都懂，IF实验也做完了。可是，为什么我的蛋白定位和别人做的不一致呢？这数据我也不敢给老板汇报啊~555~”有小伙伴向小P哭诉。

FEN1抗体（货号：14768-1-AP）染NIH/3T3细胞

FEN1是一种结构特异性核酸酶，理论上应在细胞核表达，前人研究中免疫荧光结果与预期一致，细胞核染色（左图）。
小伙伴使用相同的抗体anti-FEN1（货号：14768-1-AP）染乙醇固定的NIH/3T3细胞 ，结果细胞质着色，与预期及前人结果相悖（右图）。
小伙伴表示有亿点点委屈，为什么啊？？?
......
不要慌，作为抗体应用专家，免疫荧光小能手，小P这就给大伙儿梳理梳理，为什么会出现荧光信号不对的情况，究竟是谁的锅？

1. 固定剂的锅
做过细胞IF的同学都知道，在拿到样本之后，我们很重要的一步就是要对细胞进行固定。固定，顾名思义就是将细胞“固定”起来，这样能长久的保持细胞形态和抗原状态，让抗原能够与抗体更充分且更稳定地结合。
可有多少同学知道，固定剂也会影响蛋白（抗原）的亚细胞定位实验结果？
比如，我们研究部分核蛋白时发现如果采用乙醇固定，就会出现胞浆染色的结果。

B23/NPM1抗体（货号：60096-1-Ig）染MCF-7细胞

左图4%多聚甲醛固定MCF-7细胞（细胞核着色-阳性），右图乙醇固定（细胞质着色-非特异性着色）。

而当我们用E-cadherin抗体染细胞膜时，如果采用的是4%多聚甲醛固定，也会出现细胞核假阳性信号。

E-cadherin抗体（货号：20874-1-AP）为细胞膜着色

左图4%多聚甲醛固定MCF-7细胞（细胞核着色-非特异性着色），右图乙醇固定（细胞膜着色-阳性）。

显然，固定剂确实影响到蛋白（抗原）的亚细胞定位实验结果。不同固定剂的作用原理不同，不同靶蛋白及所用抗体特性不同，都可能影响到固定剂使用效果。因此选对合适的固定剂对一个准确可靠的IF结果是至关重要的。
上面与预期结果不一致的小伙伴其实就是因为采用了乙醇固定才导致了非特异性着色结果，前人的研究中均采用的4%多聚甲醛固定。
那么该如何挑选合适的固定剂呢？且往下看：
常用的固定剂种类很多，一般固定剂可分为两大类：可溶性溶剂和交联剂。可溶性溶剂比如丙酮、乙醇等能去除脂类物质并使细胞脱水，把蛋白质沉淀在细胞结构上。交联剂比如多聚甲醛可以通过自由氨基基团把生物分子桥连起来，形成一个相互连接的抗原网。
组织或细胞经过固定后可使胞内蛋白凝固，减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；保持组织或细胞的抗原性，避免抗原发生弥散；保持组织和细胞的固有形态和结构。
不同类型固定剂优缺点如下：

根据多年抗体开发和蛋白检测经验，Proteintech总结了一份【不同细胞器最优固定剂方法】，供大家参考：

当然，固定剂的选择其实是没有通用规则的，以上表格也是经验之谈，不排除有特殊情况。如果没有达到预期的实验效果，您也可以尝试更换其他固定试剂。
2. 通透剂的锅
说到固定剂，那就必须聊一下通透剂，通透剂没选好同样会造成IF结果不理想。
交联固定剂比有机溶剂能更完整的保持细胞结构，保存脂类物质，但也会因此而阻碍抗体-抗原的结合，甚至屏蔽抗原表位，造成阴性检测结果。因此可能需要增加一个通透步骤以使抗体能够顺利进入并接触抗原。我们可以根据靶标所处的位置进行选择使用或者不使用通透剂，以及选择何种强度的通透剂。

1）如果您检测的是胞外表位（细胞膜表面蛋白、膜整合蛋白的胞外段等），则无需进行通透，固定之后即可检测
2）如果您检测的是胞内表位（膜整合蛋白的胞内段、细胞骨架蛋白、细胞器膜外蛋白等），需选择温和的细胞通透剂，比如Digitonin、Leucoperm、Saponin和Tween 20等，它能够在膜上打孔，增加细胞膜的通透性，使抗体进入胞质中，识别胞质中的表位。
3）如果您检测的是有膜细胞器内的表位（核内蛋白、线粒体内的蛋白等），则需要采用强通透剂，比如Triton X-100和NP-40等，它们可以部分溶解细胞核膜等细胞器膜结构，使抗体进入细胞器内部识别抗原并结合抗原表位。
3. 其他可能的锅
总而言之呢，免疫荧光结果不理想，可能的原因非常多，其中固定剂和通透剂的选择也至关重要的一步，希望大家要牢记！
除此之外的可能原因，小P这里根据多年的实验经验，总结了一份【免疫荧光疑难解析】，针对各种不理想情况分析了“锅”的归属，希望对大家有所帮助！