目的蛋白是膜蛋白，做WB时想用内参检测上样量是否相等，该用哪个内参呢？大家对这个问题众说纷纭，有人说可以使用β-actin，GAPDH和Tubulin这类管家基因作为内参，因为他们通过实践证实可以得到条带。另一些人则认为这些管家基因应该只在胞浆中表达，细胞膜中不应该含有这些成分，故不能用来做内参，而可以用来检测所提到的膜蛋白是否纯净。
Actin，GAPDH和Tubulin究竟能不能做膜蛋白的内参呢？又该如何选择膜蛋白的内参呢？
01 Actin, GAPDH和Tubulin存在于细胞膜上吗？
肌动蛋白（Actin）已被鉴定为几乎所有真核细胞的组分。早在四十年前，就已有研究使用电子显微镜在原位或分离的质膜中观察到质膜和肌动蛋白丝（或具有肌动蛋白尺寸的细丝）之间的明显接触。1975年ERIC GRUENSTEIN等人【1】成功验证了肌动蛋白与3T3小鼠成纤维细胞和Hela细胞膜的结合。甚至在肌动蛋白解聚条件下，约20%-40%的肌动蛋白仍与细胞膜结合。2009年J. Wolff研究发现【2】微管蛋白（Tubulin）可通过多个水平与质膜结合：从整合膜蛋白到通过棕榈酰化的附着，到表面结合，以及通过连接蛋白附着到膜中，从而调节质膜的功能。2012年Rémi Terrasse等人【3】研究发现暴露于真核生物和细菌细胞表面的GAPDH是补体系统分子C1q主要识别的配体。
Actin, GAPDH和Tubulin主要存在于胞浆中，但通过以上案例说明，他们也可能存在于质膜中或细胞表面。故使用管家基因作为验证膜蛋白纯度的标准时，检测到这些内参的弱信号不足为奇，可更换其它内参进行纯度检测。至于是否可以用这些管家基因作为膜蛋白内参，要根据实验目的及样品本身情况决定。（详见下文）
02 细胞膜蛋白专用内参有哪些？
Na+/K+ ATPase(100KD) ：存在于细胞膜中，是对钠和钾两种离子能进行交换的主动运输的酶。1957年由J．C．Skou所发现。除猫、狗等的红细胞膜等少数例外，在动物细胞膜中都存在。可作为经典的细胞膜内参。
图片来源：Yan Zhang, et al (2019).doi.org/10.1038/s41422-019-0184-1
Pan-cadherin(135KD ,Tissue specific express)：钙粘蛋白是钙依赖性细胞粘附蛋白。在连接细胞时，它们优先以亲同的方式与自己相互作用。属于单通道I型膜蛋白。但P-Cadherin 具有一定的组织表达特异性，主要表达于胎盘、间皮组织、上皮细胞等。
图片来源：Cheng, Y, et al (2022).doi.org/10.1016/j.jcmgh.2022.01.017
03 如何选择和使用膜蛋白内参？
选择膜蛋白内参的方法：
1. 根据WB实验目的选择
如WB验证与蛋白位置相关问题，例如验证目的蛋白是否定位或转运至膜上。则需先分离膜蛋白组分（推荐Invent Cat#SM-005 质膜及细胞组分分离试剂盒），使用膜蛋白专用内参，如Na+/K+ ATPase等确认其是膜蛋白，同时还可检测其他非膜蛋白内参作为膜蛋白提取纯度的验证标准。
示例：
Leung等人[4]研究PRL3对ULBP2蛋白转运的影响。人结肠癌细胞系HCT116使用40uM PRL3-I处理后，经过Invent SM-005离心管柱法进行细胞组分分离后，分别对细胞质膜（Mem），细胞器（Org）和细胞浆（Cyto）组分进行WB检测，使用Na+/K+ ATPase作为细胞质膜内参，Tubulin作为胞浆内参，Calnexin作为总膜内参，内参的设置验证了膜蛋白及各组分的分离成功，并具有良好的纯度，组分间无交叉污染，同时说明了PRL3-I处理前后这些内参蛋白没有变化。从而验证经过PRL3-I处理后抑制了ULBP2的成熟，导致ULBP2蛋白在内质网中的滞留，而无法转运到细胞质膜上。
如WB验证膜蛋白的定性或定量问题，例如验证样品中膜蛋白是否存在或在药物处理后是否发生量的变化。则可分离全蛋白（推荐Invent Cat#SD-001/SN-002 柱式法动物细胞/组织总蛋白提取试剂盒），使用常见的管家基因做为内参即可。
2. 根据WB实验条件选择
内参蛋白在实验条件下需要保持恒定，要考虑实验中的处理条件是否会影响内参的表达，例如文献中表明使用甲状腺素处理样品会影响经典的Na+/K+ ATPase的表达，这时就需要使用其他膜蛋白专用内参来替代。
3. 根据样品选择
部分样品在细胞膜上确实含有Actin, GAPDH和Tubulin，也可以作为膜蛋白的内参，但其表达是否稳定，表达量是否足够作为内参，需要进一步确认。特别是验证蛋白定位相关问题时，要考虑是否足够严谨。也有很多样品本身在细胞膜上无法检测到Actin, GAPDH和Tubulin等内参，推荐使用膜蛋白专用内参。
4. 其他考虑因素
内参蛋白和目的蛋白相对分子量需要有差异。
04 总结
WB实验目的蛋白是膜蛋白时，能不能用Actin, GAPDH和Tubulin作为内参，首先要明确是否要验证其在细胞的分布或定位，如需验证，需要先分离膜蛋白，使用膜蛋白专用内参如Na+/K+ ATPase。如不需验证其分布及定位，表达量足够时，则可以使用总蛋白为样品，使用管家基因作为内参。
目的蛋白是膜蛋白，要根据实验目的及实验条件选择使用合适的内参！
参考文献： 【1】Gruenstein E., et al. (1975). Actin associated with membranes from 3T3 mouse fibroblast and Hela cells. Journal of cell Biology. 64:223-234. 【2】Wolff J. (2009). Plasma membrane tubulin. Biochemica et BiophysicaActa. (BBA)-Biomembranes 1788:1415-1433. 【3】Terrasse R., et al. (2012). Human and pneumococcal cell surface glyceraldehydes -3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) proteins are both ligands of human C1q protein. J. Biol. Chem. 287:42620-42633. 【4】Leung W-H. et al.(2015). PRL-3 Mediates the protein Maturation of ULBP2 by regulating the tyrosine phosphorylation of HSP60.The Journal of Immunology.doi:10.4049/jimmunol.1400817.
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