确定一抗的来源物种，二抗的反应物种与一抗的来源种属相同即可。例如一抗为鼠源抗体，二抗选择X-鼠（羊抗鼠，兔抗鼠）。
除了要与一抗的种属来源相一致，二抗还需与一抗的类别或亚类相匹配，对于多克隆抗体一般多是IgG类型，二抗可以选择X-鼠IgG（羊抗鼠IgG，兔抗鼠IgG）抗体。而单克隆抗体则相对复杂些，由于单克隆抗体有不同的类别和亚型，因此相应的二抗也需要根据这些亚型进行选择。
二抗的偶连标记：一般来讲，二抗的偶连标记物常为辣根过氧化酶和碱性磷酸酶、荧光基团和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于western blot，IHC和ELISA，常用的二抗是酶标二抗，而免疫荧光、流式细胞术中通常使用荧光基团标记的二抗。
选择哪种形式的二抗：
整个IgG分子：此种抗体适用于多数情况。 
Fab片段：它们只有一个结合位点，一般用来封闭内源性免疫球蛋白。 
F(ab')2片段：该种抗体是由两个靠二硫键连接的用于结合抗原的Fab片段组成，这些抗体用在特定的情况中，如需要避免抗体与具有Fc受体的细胞结合的情况。
实验者需要在推荐浓度周围进行多个浓度梯度的实验，从中发现最佳的稀释比例。如果说明书没有推荐稀释比例，则需要做大量的预实验来摸索最佳的稀释比例。