细胞培养后，需要对其生长情况、形态甚至生物学性状进行观察。由于细胞小而复杂，若不借助适当的手段，难以观察其形态、结构，更难发现细胞内各种组分的分子组成及功能。目前，已有多种研究细胞的技术，从光学显微镜到电子显微镜，从一般细胞化学法到免疫化学法。细胞染色是研究细胞生物学特征的一种常用手段，然而，对于细胞实验新手来说，想要获得一张漂亮的细胞染色图并不容易。染色试剂不会选、细胞染色不均匀、染色时切片脱落等都是很常见的问题。今天小爱就为大家整理了几种常用细胞染色方法及染色剂选择指南，快来学习！
表 1 几种常用细胞染色方法及特点
| 染色方法 |
染色特点及应用范围 |
| 革兰氏染色法 |
一种重要的细菌鉴别染色法，经染色后，阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，从而用以分类鉴定。 |
| 瑞氏染色法 |
瑞氏试剂中酸性伊红和碱性美蓝混合经化学作用后，变成中性的伊红化美蓝，久置后，经氧化而含有天青。此三种染料分别和细胞中的NH3+和COO-等结合，使细胞核及胞浆着色。由于系中性染料，又有缓冲液调节酸碱度，所以细胞受染后，蓝红等颜色都较适中，核染质、胞浆以及其中颗粒显色较为清楚。 |
| 姬姆萨染色法 |
病理学以及疾病研究中常用的染色剂。染色原理和结果与瑞氏染色法基本相同。但该法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更清晰，而细胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。 |
| 免疫组化染色法 |
利用抗原抗体之间的特异性结合，用于研究细胞产物如分子、蛋白质或糖蛋白的表达、定位、分布和迁移等。 |
了解细胞染色方法后，下面小爱向大家介绍研究不同细胞结构用到的荧光染料。
一、细胞膜常用染料
DiD、DiR、DiO 和 DiI 染料是最常见的细胞膜染料（见表2），它们是一族亲脂性的荧光染料，用于细胞的形态学和结构研究。该系列染料进入细胞膜后，会在整个细胞膜上侧向扩散，在最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。其中 DiD 染料的染色效率高，染色均一，荧光不易猝灭，无明显细胞毒性，且受自身荧光背景干扰小。目前 DiD 已成功应用于多种细胞的体内示踪研究，如 Treg 细胞、间充质干细胞、肿瘤细胞、造血干祖细胞等。
表 2 细胞膜常用染料及荧光颜色
| 货号 |
产品名称 |
荧光颜色 |
λEx(nm)/ λEm (nm) |
| DiD P-chlorobenzenesulfonate(DilC18(5)) |
红色 |
644/663 |
|
| DiR 碘化物 |
深红色 |
748/780 |
|
| DiO 高氯酸盐 |
绿色 |
484/501 |
|
| DiI 高氯酸盐 |
橙色 |
549/565 |
二、其他细胞结构常用染料
生物染料在细胞结构和组分鉴定中有着广泛的应用，除细胞膜研究外，我们经常也会对一些其它细胞结构及成分进行探索，例如线粒体、溶酶体、蛋白质、细胞核等，而对于不同的细胞结构有不同的染料进行染色，小爱总结如下：
表 3 常用细胞染料及用途
| 货号 |
产品名称 |
产品用途 |
| DAPI染色液 |
细胞和组织细胞核染色。 |
|
| TRITC-Phalloidin |
选择性结合丝状肌动蛋白 F-actin，用于细胞骨架研究。 |
|
| 台盼蓝染色液（0.4%） |
常用于检测细胞膜完整性和细胞存活率。 |
|
| 姬姆萨染液 |
用于染色体、血液、组织切片、原生动物寄生虫等。 |
|
| Hoechst 33342 |
标记 DNA，也用于细胞核和线粒体的显像观察。 |
|
| JC-10 |
可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。 |
|
| 吖啶橙盐酸盐 |
细胞周期研究，细胞培养物和组织模型的凋亡研究。也能用作溶酶体染料，但缺乏特异性。 |
|
| (+)生物素-N-琥珀酰亚胺基酯 |
在温和条件下标记蛋白质、肽、细胞器、抗体、寡核苷酸和微珠。 |
三、细胞染色神器 DAPI + Phalloidin
DAPI 染色液（DAPI Staining Solution）常用于细胞核染色，可将细胞核染成蓝色。鬼笔环肽（Phalloidin）是细胞骨架的染色神器，罗丹明标记的 Phalloidin（TRITC- Phalloidin）可将细胞染成橙红色，DAPI 与 Phalloidin 染色液是研究细胞形态变化时经常用到的两种共染的试剂，染色效果可见图1[1]：A1-E1 用 TRITC-鬼笔环肽（橙红）染色的细胞骨架免疫荧光图；A2-E2 用 DAPI（蓝色）染色的细胞核免疫荧光图；A3-E3 合并的 L929 细胞免疫荧光染色图。图 2[2]是 S100A16 过表达或下调前后 PDAC 细胞形态的变化。
注意事项：
※ 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测；
※ 避免反复冻融，否则容易失效；
※ DAPI 对人体有刺激性，注意适当防护；
※ 鬼笔环肽具有毒性，需小心操作（对人的半数致死剂量 LD50 约 2mg/kg）。
参考文献：
[1] Li J, Chen JN, Peng ZX, et al. Multifunctional Electrospinning Polyhydroxyalkanoate Fibrous Scaffolds with Antibacterial and Angiogenesis Effects for Accelerating Wound Healing[J]. Applied Materials & Interfaces. 2022.
[2] Li T, Ren TY, Huang CM, et al. YS100A16 induces epithelial-mesenchymal transition in human PDAC cells and is a new therapeutic target for pancreatic cancer treatment that synergizes with gemcitabine[J]. Biochemical Pharmacology 189 (2021) 114396.
| Question |
Answer |
| Q1：用 DAPI 和鬼笔环肽染细胞的先后顺序是什么？ |
一般情况下先用鬼笔环肽对细胞骨架进行染色 20~40 分钟，PBS 清洗细胞 2 次，再用 DAPI 复染 10~20 分钟。可根据实际染色情况缩短或延长时间。 |
| Q2：用 DAPI 染细胞核时，整张图片显示蓝色是什么原因？ |
染色时应注意滴加量不要太多，否则会造成整张图像呈现蓝色背景，只需覆盖上薄薄的一层即可。此外，荧光染料存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。 |
| Q3：DAPI 染色中避光的操作到底要多严格才不至于影响结果？ |
DAPI 相对很容易染上色，避光处理时加样等操作短时见光没有关系，但是不操作的时候需要暗盒或锡纸包裹，染色后应尽快检测。 |
| Q4：我的细胞样品转染了带有 GFP 的质粒，应该选择哪种鬼笔环肽？ |
可以选择 TRITC（橙红）或是 Fluor 700（远红）标记的鬼笔环肽。 |
| Q5：鬼笔环肽有好多种，它们的区别是什么？我应该如何选择？ |
主要是荧光基团的差异，激发不同的荧光颜色，用来区分共染时其他荧光染料的颜色，选择时应满足机器激发和发射波长。 |
| Q6：鬼笔环肽可以染活细胞吗？什么染色剂可以染活细胞？ |
鬼笔环肽不能直接应用于活细胞的染色，因为它无法穿越细胞膜。DAPI 可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。 |
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