• WB 上样前一定要加热变性吗？

• 用变性裂解液提取的蛋白已经变性了，还需要加 Loading buffer 再加热变性吗？

• 膜蛋白和普通蛋白热变性条件一样吗？

• 膜蛋白样品煮沸之后，WB 检测 Na⁺/K⁺ATPase 内参为什么没有条带？

• 蛋白样品煮过后于 -80 ℃ 储存，再次使用前还需要再煮吗？

在 WB 样品制样过程中你是否一直有以上这些疑问？今天咱们就来一探究竟！

 

WB 上样前一定要加热变性吗？

凝胶电泳之前蛋白质需要进行变性预处理，以确保蛋白质变成一级结构线性表位，便于与一抗抗体结合。通常情况下，蛋白样品加入上样缓冲液（Loading buffer），沸水浴 5 min 或者是 PCR 仪 95 ℃ 处理 5 min 即可，这个过程即是热变性。

热变性过程利用 Loading buffer 里的还原剂二硫苏糖醇（DTT）或者巯基乙醇，打断蛋白间的二硫键使之成为线性。同时蛋白肽链上的氨基酸与 Loading buffer 中的 SDS 结合，使整个肽链携带上负电荷，使蛋白之间只有大小区别，跑电泳时即可通过小蛋白在前、大蛋白在后区分开。

▶   答案：WB 样品上样前一定要加热变性。

 

 

蛋白已经变性了还用加 Loading buffer 再变性吗？

WB 蛋白样品制备通常会使用变性裂解液，因此提取得到的蛋白已经变性，但在 WB 凝胶电泳前仍需要加上样品缓冲液进行热变性。变性裂解液在裂解细胞提取蛋白时，变性裂解液因含有离子型表面活性剂使得蛋白的高级结构（二级结构，三级结构）被破坏，但仍可能有部分蛋白没有完全成为一级结构。

所以在 WB 上样之前需要加 Loading buffer 进行热变性使蛋白更加彻底的变性。而且 Loading buffer 中含有的溴酚蓝可以起到指示作用，显示电泳进程，成分中的甘油还可以加大样品密度，使样品沉到样品孔里，防止样品飘出。

▶ 答案：虽然提取蛋白的过程已经使蛋白变性，仍然需要加 Loading buffer 进行热变性。

 

膜蛋白应该怎么热变性？

分离提取的亚细胞结构，例如细胞质膜、线粒体、高尔基体、内质网、溶酶体以及内体等这些亚细胞结构用变性溶解液溶解后，依然需要加 Loading buffer 进行热变性。但是膜蛋白在高温煮沸时，容易发生聚集现象，形成二聚体或多聚体，聚集后分子量变大，造成后续无法检测到条带或检出的条带位置不对。这也是膜蛋白样品煮沸后，WB 检测 Na⁺/K⁺ATPase 质膜内参蛋白，没有条带的原因。多家抗体公司在说明书里指出，膜蛋白样品不宜煮沸，建议 70 ℃ 左右进行热变性。

还有一些对热特别敏感的蛋白，对热变性的温度有特殊要求。植物样品中对热敏感的蛋白比较多，有的蛋白热变性温度需要与感受态转化温度（42 ℃）一样，过高则检测不到。

例如，某老师在进行植物质膜蛋白 WB 检测时，70 ℃ 热变性，内参可以检测到，但目标蛋白却检测不到，为此将样品做了梯度温度热变性后检测（见下图），经过实验发现目标蛋白在 30 ℃ 热变性时检测效果最佳，随着热变性温度增高，条带减弱，至 70 ℃ 时完全无法检测出。

▶ 答案：如果样品是膜蛋白，需要根据样品本身情况，谨慎调整热变性的温度，以提高检测效率。

 

冷冻过的样品再使用还要再次加热吗？

样品加 Loading buffer 煮过后分装放在 -80 ℃ 冻存，如果是短期存放一两周，可以不用再次加热，因为 Loading buffer 里的还原剂还没有消耗光，蛋白还处于稳定变性中。还原剂消耗完后，线性结构蛋白被打开的二硫键就又会构建成新的二硫键，蛋白因此可能会出现沉淀。

▶ 答案：短期不用，但长时间的保存后再使用时需要按照原来热变性温度进行变性，同时还需要补加还原剂。

 

 

小结

综上可知，WB 电泳前制样的热变性不是简单煮沸；提取的蛋白已经变性依然需要进一步热变性；分离得到的膜蛋白进行 WB 试验千万不要煮沸，70 ℃ 左右即可；热敏感的蛋白，检不到的时候，可以摸索调整一下热变性的温度；煮样之后冻存的样品，需要根据情况添加还原剂以及热变性后才可以使用。

 

相关产品推荐：

美国 INVENT 公司专注于蛋白样品制备十余年，深挖开创柱式法总蛋白提取工具，1 min 可得细胞样品变性总蛋白（SD-001/SN-002），总蛋白更全 WB 检测才更容易出结果。柱式法亚细胞结构分离平台，可提供细胞内部各个亚细胞结构分离工具，从细胞核内部的核基质，核膜，再到细胞核，内质网，高尔基体，溶酶体，内体，蛋白酶体，线粒体，细胞浆，细胞质膜等 INVENT  都有对应分离工具，协助您完成蛋白功能机理的研究。