嵌合抗原受体(CAR) T细胞疗法已被FDA批准用于B细胞急性淋巴细胞白血病的治疗，在白血病和淋巴瘤方面CD19靶向的CAR T细胞疗法表现出显著的疗效，但是接受T细胞治疗的病人反应是可变的，大多数临床试验表明重复侵入性活检并不实用。研究人员目前正在努力评估CAR -T细胞治疗实体瘤的疗效，然而T细胞治疗进展的一个关键限制是缺乏T细胞在患者体内的生物分布信息。因此，有必要确定一种可转化的方法来无创地追踪治疗性T细胞，将有助于优化个性化治疗方案和联合治疗。
    近期研究表明利用嵌合抗原受体(CAR) T细胞靶向免疫检查点分子B7-H3 (CD276)取得了很好的结果，CD276是骨肉瘤中显著上调的一种肿瘤抗原。该分子是B7和CD28家族的成员，在肿瘤细胞上广泛表达，被认为对T细胞功能起抑制作用。该研究开发了一种基于MRI的细胞追踪技术，使用定制的微流控设备将氧化铁纳米颗粒（Ferumoxytol）对人抗B7-H3 CAR-T细胞进行机械标记，以演示CAR-T细胞的无创和多模态成像，旨在开发一种可转化用于临床试验中监测T细胞的方法。
实验结果
    流式细胞术检测经抗B7 - H3基因转导的T细胞的转导效率为74.72±3.23%，而未转导的(NT) T细胞的转导效率为0.94±0.26%(图1A)；使用微流控装置机械操作导致CAR - T细胞对氧化铁纳米颗粒的吸收更明显(P<0.0001) ；在标记后第1、3、5天采用细胞计数试剂盒8 (CCK-8)法评估机械操作对T细胞增殖的影响，表明其标记的T细胞保持着细胞活力。

图1 B7-H3 CAR-T细胞的表达谱和标记效率

对标记细胞进行体外功能实验
    B7-H3 CAR-T细胞与MG63.3骨肉瘤细胞共孵育表明，机械操作不改变T细胞的增殖和功能，降低了MG63.3细胞的活力；在机械操作后受刺激的抗B7-H3 CAR-T细胞释放干扰素-γ (IFN-γ)得以维持，并迁移到肿瘤部位，发挥抗肿瘤作用；检测极限和确定最佳成像窗口是临床利用分子成像策略的基本考虑，MRI检测限为2 × 10⁴ Ferumoxytol 标记的B7-H3 CAR-T细胞，MPI检测限为2 × 10³Ferumoxytol 标记的B7-H3 CAR-T细胞。

图2 CAR-T细胞在体外维持功能

Ferumoxytol 标记的CAR-T细胞的多模态成像
    用MRI、PAT和MPI评估Ferumoxytol标记CAR-T细胞在体内的肿瘤积累的骨肉瘤小鼠模型的设计。静脉注射Ferumoxytol标记的B7-H3 CAR-T细胞(肿瘤+CAR+iron组)，未标记的B7-H3 CAR-T细胞(肿瘤+CAR组)，或NT Ferumoxytol的T细胞(肿瘤+NT+iron组)，无肿瘤的对照组动物注射Ferumoxytol标记的B7-H3 CAR-T细胞(CAR +iron)。在注射T细胞前的第1天和注射T细胞后的第1、2、3周获得图像。
    骨肉瘤中Ferumoxytol标记的CAR-T细胞的积累，在第1周通过MRI确定，与第3周肿瘤大小的减小相关。组织学分析进一步证实了Ferumoxytol标记的CAR-T细胞在肿瘤部位的聚集。Ferumoxytol增强MRI以剂量依赖性的方式检测铁标记CAR - T细胞在肿瘤和非目标部位的积累。普鲁士蓝染色证实了Ferumoxytol标记的B7-H3 CAR-nLuc T细胞的分布。

图3 MRI检测Ferumoxytol标记的CAR T细胞

Ferumoxytol标记CAR-T细胞的PAT成像
    为了证实磁共振成像的发现，研究还评估了骨肉瘤中Ferumoxytol标记的CAR-T细胞的积累是否可以使用PAT可视化，这是一种相对便宜、临床适用的方式，不需要使用电离辐射。静脉注射Ferumoxytol标记的B7-H3 CAR-T细胞后，与处理前的扫描相比，第1周的光声信号明显增加。与MRI上观察到的信号动力学相似，在用Ferumoxytol标记的B7-H3 CAR-T细胞处理的动物中，第二周的光声信号比第一周低2.3倍。在第1周Ferumoxytol标记的NT CAR-T细胞处理的肿瘤光声信号明显低于Ferumoxytol标记的B7-H3 CAR-T细胞处理的肿瘤。与处理前的图像相比，未标记B7-H3 CAR-T细胞在输注后W1和W2处理的动物光声信号无明显变化。
MPI检测Ferumoxytol标记的CAR-T细胞
    虽然MRI可以立即用于临床，但纳米颗粒诱导的MRI信号效应的量化是复杂的。MPI的优势是它可以直接定量铁纳米颗粒，MPI只显示来自氧化铁纳米颗粒的信号，没有任何背景噪声。Ferumoxytol标记的B7-H3 CAR-T细胞静脉输注后的MPI图像证实了抗B7-H3 CAR-T细胞在肿瘤组织中的积累(图4F)。在定量上，第1周与输注未标记B7-H3 CAR - T细胞的动物相比，用Ferumoxytol标记B7-H3 CAR-T细胞治疗的肿瘤中检测到的铁浓度明显更高。在输注Ferumoxytol标记的NT CAR-T细胞后，与注射未标记的B7-H3 CAR-T细胞的动物相比，第1周的铁纳米粒子信号明显升高。然而，在第1周和第2周注射Ferumoxytol标记的NT CAR-T细胞的动物的初始信号增强明显低于Ferumoxytol标记的B7-H3 CAR-T细胞治疗的肿瘤。相比之下，未标记的B7-H3 CAR-T细胞输注后，肿瘤内MPI信号没有明显增强，氧化铁纳米颗粒水平也没有明显升高（图4G）。

图4 用PAT和MPI显示Ferumoxytol标记的CAR-T细胞

    总的来说，该研究提供了一种基于微流控技术的机械方法，用Ferumoxytol标记人类CAR T细胞，并使用多模态方法，在临床前模型中对静脉输注的Ferumoxytol标记的CAR T细胞进行体内成像，该模型有可能用于临床转化。   用双PET MR对用copper-64超顺磁性氧化铁纳米粒子标记的CAR T细胞进行的第一项人体研究证明了转化的可行性，该研究还发现，Ferumoxytol标记的T细胞的功能可以保持，并在受试者体内保持了很长一段时间的持续性。该成像方法可用于以剂量依赖性的方式监测治疗细胞的定位，并有助于阐明实体瘤T细胞治疗产生应答和无应答的因素。