组织驻留淋巴细胞是指在肺、皮肤、肠道等非淋巴组织中具有组织驻留特征的一类淋巴细胞，因其在控制感染、调节代谢、修复损伤等功能特征成为免疫学研究新兴热点。相比于循环性淋巴细胞，组织驻留淋巴细胞具有诸多差异化的表型特征。波士顿大学医学院Belkina等人利用Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪搭建了22色小鼠肺部组织驻留细胞高维分析方案，在揭示其类群异质性的同时发现CD73可作为T_RM细胞特异性标志物¹，相关研究工作发表于Cytometry Part A。

 

图1. 全光谱流式22色方案高维分析数据展示

 

该研究使用小鼠肺炎球菌感染模型作为实验体系，并参考了多篇经典研究论文进行标志物选择，方案主要针对循环及组织驻留T、B细胞亚群进行深度分析（图2）。为避免循环性淋巴细胞干扰，研究人员向小鼠活体中注入CD45.2-BUV737进行体内标记，并在流式分析中圈门排除。CD45.2^-CD45⁺肺部淋巴细胞经Phenograph聚类分为21个细胞类群，并由t-SNE降维展示（图1）。

 

图2. 目标细胞类群表面标志物表达情况

 

T细胞聚类分析中，CD4+T细胞被分为CD4+T_naive细胞（类群10,20）、CD4+T_EM细胞（类群8,17）以及CD4+T_RM细胞（类群1,3,5,6,7,18），其中CD4+T_RM细胞表现出丰富的表型异质性，与该团队前期发表与Nature Communications的研究工作结果对应²；相比之下，CD8⁺T_RM细胞仅被归类于类群13；CD4^-CD8^-T细胞中可能包含如γδT、NKT、MAIT细胞等固有免疫T细胞类群，但该方案中未添加相关细胞群体标志物。

值得注意的是，该研究首次发现原本用于表征B_mem的标志物CD73在CD4+T_naive以外的所有肺部CD3+T细胞类群中高表达，且表达量远高于B_mem细胞。因此，该研究建议将CD73作为T_RM特异性标志物，结合CD62L^-CD44⁺CD69⁺CD11a⁺表型进一步提升T_RM鉴定准确性。

 

图3. 相比于血液中的循环性淋巴细胞，T_RM细胞表达更高水平的CD73

 

B细胞聚类分析中，多个已知的肺组织驻留B细胞群体同样被清晰分辨，其中包括B_naive细胞（类群2,9,16），B_RM细胞（类群11,14），GL7+B_RM细胞、B1 B_mem细胞（类群12，CD44^highCD11a⁺CD69^-）以及B1 B_RM细胞（类群4，CD44⁺CD11a⁺CD69⁺）等。B1 B_RM细胞的存在经肺炎感染组与生理盐水组的对照实验进一步得到验证。手动圈门结果显示B1 B_RM细胞高表达驻留记忆标志物CD69与记忆标志物CD44、CD38，而淋巴结归巢受体CD62L低表达（图4）。

 

图4. 手动圈门分析B1 B_RM细胞标志物表达

 

22色小鼠肺部组织驻留细胞光谱流式方案明细如图5所示，由4激光（BRVY）Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪收集数据。考虑到方案普适性，该多色方案未使用任何成本高昂且货期更长的定制荧光抗体。在非定制试剂选择受限的情况下，方案中不可避免地使用了eFlour450/BV421、APC/AF647等光谱相似染料组合，但在光谱流式检测中，所有标志物均得到良好的信号分辨。

 

图5. 22色组织驻留淋巴细胞光谱流式方案明细

 

 

总 结

结合全光谱流式22色高维分析方案与Phenograph聚类分析，该工作深度揭示了肺炎球菌感染小鼠模型中肺组织驻留T、B细胞的表型多样性。作者在文章中特别提到：相比于多管检测，Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪高维分析方案更适用于丰度较低且表型多样的组织驻留淋巴细胞分析；仪器出众的多色分辨能力与灵敏度为优异的数据质量提供了重要帮助。更多方案详情，欢迎阅读参考文献原文。

 

参考文献：

Shenoy A T, Lyon De Ana C, Barker K A, et al. Comprehensive phenotyping of murine lung resident lymphocytes after recovery from pneumococcal pneumonia[J]. Cytometry Part A, 2021.

Shenoy A T, Lyon De Ana C, Arafa E I, et al. Antigen presentation by lung epithelial cells directs CD4+ TRM cell function and regulates barrier immunity[J]. Nature communications, 2021, 12(1): 1-16.

 

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