“华银康集团高通量测序检测中心CUT&Tag测序在整个实验过程中无需甲醛交联、超声打断、末端修复和连接接头等操作，
通过对细胞预处理、免疫共沉淀、文库构建等关键过程进行技术改进，对ChIP-Seq技术进行全面革新，成为DPI研究的最佳选择[1]。”
与传统ChIP-Seq工作流程比较 [1]
注：与ChIP-Seq研究方法相比，无需交联、超声打断、末端抹平和接头连接等操作，因此更省时，更高效，所需的样品量少。
技术路线
CUT&Tag性能确认测试结果展示
为了对CUT&Tag技术方法做性能确认，华银康高通量测序科研团队分别对样本重复性、最低细胞投入量和同行试剂比对这3个指标进行测试。
1 重复性测试
用3例样本分别进行重复性测试，CUT&Tag质控数据均符合要求，以hg38为参考基因组，F1、F2、F3比对率均在95%以上，序列比对基因组情况均达标。
通过对3例样本测序结果插入片段进行统计，发现3个样本的文库特征峰相似，均符合Tn5酶周期性分布特征，符合重复性要求。
通过对F1、F2、F3这3例样本的测序数据进行IGV可视化展示，发现3个样本的峰信号相似，符合重复性要求。3个样本的reads分布相似，在TSS区域存在明显富集。Peak数量在3个样本中相近，并在较为理想范围内。
F1、F2、F3插入片段统计和reads分布特征
F1、F2、F3这3个样本功能元件分布相似性高，测试结果显示其重复性符合要求。组内样本的相同基因数重合率极高，3个样本motif预测结果50%相似，具有较强的重复性。
F1、F2、F3功能元件分布、组内差异基因和motif韦恩图
2 最低细胞投入量测试
分别对不同细胞投入量的样本进行测试，并使用不同一抗进行富集，以验证测试目的。比如在CTCF三个样本不同细胞投入量的条件下，均可见明显CTCF motif。
CTCF三个样本的motif分析
经测试，符合原始质控数据要求的最低细胞投入量为1万，样本peak数、motif分析等指标内容均达标。
技术优势
1 无需甲醛交联 去交联、DNA打断、标记 实验周期更短
CUT&Tag实验流程中，pA-Tn5酶的使用是一个重要创新[1]，这种融合蛋白可以实现与二抗的互作，并能够实现对目标区域的直接切割和标记，从而不再需要对细胞进行甲醛交联和DNA片段化，可将整个实验周期缩短至一天。
CUT&Tag与ChIP-Seq及CUT&RUN比较 [2]
2 信噪比更高 细胞需求量大大降低
CUT&Tag在peak区域展示出远高于ChIP-Seq和CUT&RUN的信号强度，且背景远低于ChIP-Seq。同样由于pA-Tn5酶的使用，CUT&Tag技术可同时完成对目标区域DNA的片段化和测序接头添加，并将片段化产物释放到细胞外。在此过程中，绝大部分非特异性染色质区域还留在细胞核内，因此整个实验的信噪比大幅提高。
使用CUT&Tag、ChIP-Seq及CUT&RUN对多种组蛋白修饰及RNA Pol II的分布进行分析 [3]
3 重复性好 信号富集强
由于整个实验步骤的减少，相比于ChIP-seq和CUT&RUN，CUT&Tag在重复样本之间表现出更高的数据相似度，可重复性高。相关性热图表明，对于H3K4me1这个标记，CUT&Tag的两个重复样品表现出更高的信号组内相关性；在测序数据量相同的情况下，CUT&Tag的peak region内数据量更多，信号更强 [3]。
相关性热图和peak-calling 效率比较
4 能对极少量细胞甚至单细胞进行分析
得益于pA-Tn5酶的高敏感性，CUT&Tag技术可在单细胞水平实现DPI的分析。
single cell CUT&Tag (scCUT&Tag)实验工作流程 [3]
5 Peak在基因功能元件上的分布
为了进一步研究蛋白修饰的结合位点特征，理解蛋白修饰对基因调控的机制，统计peak在各基因功能元件分布个数，使用R包绘制peak在基因功能元件上分布饼图和upset图，比如基因功能元件分布在Promoter、5’UTR、3’UTR。
基因功能元件分布饼图
Peak在基因功能元件上的分布饼图
6 Motif分析
Motif 是具有某种生物特性，在一组相关序列中重复出现的序列模式，是研究基因表达调控机制的重要信息。CUT&Tag所研究的转录因子或组蛋白，其结合位点可能存在特定的序列特征。为尝试得到这种修饰结合的保守序列信息(motif 序列)，进一步理解蛋白修饰对基因表达的调控，选取call peak得到的summit上下游250bp的序列进行motif预测。
Motif分析
技术应用
案例解析：ATAC-seq + CUT&Tag+ bulk RNA-seq+ scRNA-seq联合应用，揭示BATF在肺ILC2s细胞中介导组织修复的分子机制
2022年1月14日，威斯康星医学院微生物学和免疫学系Weiguo Cui团队在Science Immunology（IF：17.73）在线发表了题为BATF promotes group 2 innate lymphoid cell–mediated lung tissue protection during acute respiratory virus infection 的研究论文[4]。
文章采用scRNA-seq、bulk RNA-seq、ATAC-seq、CUT&Tag测序，揭示了BATF在诱导ILC2s细胞愈合基因表达并促进组织损伤修复方面的作用机制。该研究利用scRNA-seq确定与病毒侵染后修复的ILC2s亚群，并发现BATF基因可能与抗炎和修复相关；进一步利用bulk RNA-seq分析，确定了BATF与抗炎、细胞增殖等方面的关系；通过ATAC-seq明确BATF促进抗炎、增殖、修复相关基因的染色质开放，并结合CUT&Tag-seq进一步验证结果，为急性病毒感染期间炎症消除提供了潜在的药物治疗靶点。
BATF促进组织修复基因表达并抑制炎症基因
参考文献：
[1]Kaya-Okur, H.S., et al., CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Cold Spring Harbor Laboratory, 2019.
[2]Tao X, Feng S, Zhao T, Guan X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 2020;16:120. Published 2020 Aug 31. doi:10.1186/s13007-020-00664-8.
[3]Kaya-Okur HS, Janssens DH, Henikoff JG, Ahmad K, Henikoff S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc. 2020;15(10):3264-3283. doi:10.1038/s41596-020-0373-x.
[4]Kaya-Okur, H. S., Wu, S. J., Codomo, C. A., Pledger, E. S., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., ... & Henikoff, S. (2019). CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature communications, 10(1), 1930.
[5]Wu, X., et al., BATF promotes group 2 innate lymphoid cell–mediated lung tissue protection during acute respiratory virus infection. Science Immunology, 2022. 7(67): p. eabc9934.
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