文章亮点：
1. 该研究评估了对转移性去势抵抗性PC (mCRPC)患者的CTCs和cfDNA进行细胞和分子分析以及CT扫描的放射组学无创分析的可行性。
2. 对22名患者的CTC计数，染色以检测PC相关标记物，并基于形态测量和免疫荧光特征使用机器学习进行聚类，对单个CTC、对应的cfDNA和buffer coats的DNA进行目标区域测序，检测到PC相关基因共享和特有的体细胞变异。对同一患者在CT扫描中发现的骨转移进行放射组学分析，发现了一个与CTC计数和血浆cfDNA水平高度相关的特征。
3. 以多参数方法整合细胞、分子和放射学数据是可行的，可以产生互补信息，使更全面的非侵入性疾病建模和预测成为可能。
传统的组织活检在晚期转移性疾病[1]中的应用有限，这促使该领域考虑替代诊断工具，如放射组学[2]和液体活检[3]。这些技术具有可重复性、非侵入性或微创性，并有望发现预后生物标志物，只需一次抽血，即可对循环肿瘤细胞(CTCs)、细胞游离DNA和RNA、胚系DNA和细胞外囊泡进行表征。虽然单独分析液体活检成分获得了重要的见解，但迄今为止，很少有研究试图直接比较从循环细胞中获得的基因组信息与从同一血液样本中获得的细胞游离物质。这些研究对于确定哪些分析物提供了最相关的疾病和临床可操作的信息是至关重要的。此外，整合来自多个液体活检组件的信息，有可能产生更全面、更准确的进化疾病的分子特征，并最终获得更有效的生物标志物来指导治疗。另一个辅助的、非侵入性的方法监测晚期前列腺癌的治疗是放射组学成像分析的新兴领域。放射组学分析是从标准医疗成像(如CT)中提取定量成像特征。在前列腺癌中，也开始研究这些放射组学特征与预后生物标志物之间的关系，目的是利用成像生物标志物补充基因检测。
该研究在晚期前列腺癌患者队列中，评估了一种多参数、非侵入性分析方法的可行性，该方法整合了液体活检读出CTC计数、CTC Arv7和SYP染色、单个CTC和对应血浆cfDNA的基因组分析、CTC聚类分析，并结合骨转移伴发CT的综合放射学分析。研究目的是评估是否可以使用RareCyte公司的CTC表征技术和相同的靶向测序获得所描述的液体活检读数，从而可以直接比较cfDNA和CTC变异。此外，评估基于CT的无创放射学分析如何与对应患者的CTC和cfDNA读数相关。
研究结果
1. CTC计数和免疫荧光定量
图1 多参数液体活检工作流程。(A).抽取外周血被分离成血浆和单核细胞成分，从血浆中提取cf-DNA，CTC和WBC是通过免疫荧光染色和自动化高含量成像鉴别出来的，单细胞被检索用于提取DNA，血浆和单细胞来源的核酸用来生成扩增子文库测序。对匹配的CT扫描进行图像分割、ROI定义、特征提取和统计分析。(B).本研究中患者、样本和工作流程的配对图。
图2 (A).CTC计数显示为Cell Search和 Rarecyte计数的比较；(B)具有代表性标记物阳性/阴性成像；(C).12例前列腺癌患者的284例CTC的ARv7 MFI分布；(D).12例前列腺癌患者284例CTC的SYP MFI分布;(E).12例前列腺癌患者的284例CTC中SYP与ARv7 MFI的分布情况。
第二管血样用于Arv7单独或联合SYP的定量免疫荧光表征(图2B)。共分析12例患者的284例CTC；≥1例Arv7+ CTC的患者有4例(33%)，≥1例SYP + CTC的患者有5例(42%)，其中3例同时存在Arv7+和SYP+CTC。Arv7、细胞角蛋白(CK)和SYP MFI分布在每个受试者的个体CTC中是高度可变的，表明患者内部存在大量异质性。值得注意的是，在分析的284个CTC中，Arv7和SYP似乎是相互排斥的，两者只有1个CTC阳性。
2. 配对CTC和cfDNA靶向扩增子测序
使用RareCyte的集成Cytepicker模块，15名有CTCs的受试者成功回收了单个CTC(每个样本回收的CTCs范围为1-4个)。共分离37个独立CTC和30个白细胞(WBC)作为胚系对照。所有CTC和WBC单细胞DNA (scDNA)样本，对应cfDNA，和buffer coat DNA (bcDNA)进行文库生成并测序。
图3 液体活检标本测序结果汇总。(A).在cfDNA和CTC中使用胚系突变检测估计变异检出敏感性和阳性预测值。(B).在患者队列中检测cfDNA和CTC的体细胞变异。(C).基因水平拷贝数(CN)估计在cfDNA和CTC中的分布，拷贝数变异分别列示。
在cfDNA和CTC中，常见的前列腺癌相关基因包括AR、TP53、PIK3CA、ALK和PTEN中发现了变异(图3B)。在所有患者cfDNA中共检测到16个sSNV;而在所有患者的CTC中发现了38个sSNV。在所有患者的CTC中观察到的体细胞变异的数量从0到11，其中大多数变异仅在一个CTC中发现，这可能表明CTC变异之间存在高度的异质性(尽管在少数患者中)。类似地，虽然一些突变在配对CTC scDNA和cfDNA的受试者之间是一致的，但大多数突变是截然不同的(图3B)。
在常见的前列腺相关基因中发现了拷贝数扩增，最突出的是AR，其次是ARAF、FGFR1和CDK6。在6例患者中，cfDNA(范围5.3-32.0拷贝)和CTCs(4.4-43.5拷贝)中均发现AR拷贝数增加，受试者配对cfDNA和CTCs之间以及CTC和CTC之间的CN检出具有高度一致性(图3C)。
3. 聚类分析
通过使用形态学特征预测K-means机器学习识别的聚类CTCs个数和预测准确度(灵敏度/特异性)。在患者水平，分析个体内某一簇下的细胞计数百分比与总CTC数和cfDNA水平之间的相关性。
图4 聚类分析结果。第一种方法利用PCA简化的特征集确定为8个聚类(86/400)；第二种使用了11种分类中指定的单一特征，这些特征捕获了核、细胞角蛋白和细胞形状和纹理特征的混合物，进行及其学习发现2个集群。
4. 放射组学和液体活检读数之间的联系
图5 热图描述了每个放射组和分子特征之间的关联模式。
在这里发现具有高放射学异质性的患者与高CTC计数、血浆cfDNA水平和CTC形态相关，以独特的群集为代表。
图6个体患者的多参数剖面：A. 单个mPC患者的液体活检结果总结。B.对转移性骨病变(圆形ROI)进行放射组学分析。
对液体活检成分的初步分析显示，在CellSearch和RareCyte平台上均发现高浓度cfDNA(血浆中35.3 ng/mL)和高CTC计数，分别鉴定出18个CTC /7.5ml和30个CTC /7.5ml。在RareCyte平台上进一步的CTC表型分析显示，约30%的CTC为Arv7阳性，其中Arv7 CTC表现出广泛的MFI值。没有SYP阳性的CTCs表明有神经内分泌表型。对三个个体的CTC进行sSNV分析，发现AR(所有CTC)、TP53(所有CTC)、KRAS(1个CTC)和CCND3(1个CTC)中存在体细胞变异。TP53和AR最常见的两个改变是在配对的血浆cfDNA样本中发现的。有趣的是，这两个同样的体细胞变异(AR T878A和TP53 D281E)与6个月之前骨转移活检的实体瘤NGS结果一致。此外，在液体活检cfDNA (n = 7.5)、CTCs (n = 5.5、6.0、7.6个拷贝)和实体肿瘤NGS中，发现AR扩增的拷贝数具有显著的一致性。其他癌症相关基因如CTC中的ARAF、SF3B1和cfDNA中的KIT也有扩增。放射组学分析显示，该患者骨转移瘤的熵值、对比度、偏度和峰度分别为1.91、1.88、−1.98和8.6，考虑到整个研究样本的分布，熵值、对比度和峰度较高，偏度较低。较高的熵值、对比度和峰度值和较低的偏度值与该ROI的灰度水平的高度异质性相关，并构成与较高的CTC计数和cfDNA水平相关的特征模式。
在这项研究中，以多参数方法整合细胞、分子和放射学数据，将使更全面的复合疾病监测模型预测治疗反应、疾病进展和总生存期。
参考文献：
1. Liu, Zihao et al. “Application of metastatic biopsy based on "When, Who, Why, Where, How (4W1H)" principle in diagnosis and treatment of metastatic castration-resistance prostate cancer.” Translational andrology and urology vol. 10,4 (2021): 1723-1733. doi:10.21037/tau-21-23
2. Ferro, Matteo et al. “Prostate Cancer Radiogenomics-From Imaging to Molecular Characterization.” International journal of molecular sciences vol. 22,18 9971. 15 Sep. 2021, doi:10.3390/ijms22189971
3. Lu, Yi-Tsung et al. “Current status of liquid biopsies for the detection and management of prostate cancer.” Cancer management and research vol. 11 5271-5291. 6 Jun. 2019, doi:10.2147/CMAR.S170380
4. Morrison, Gareth et al. “Non-Invasive Profiling of Advanced Prostate Cancer via Multi-Parametric Liquid Biopsy and Radiomic Analysis.” International journal of molecular sciences vol. 23,5 2571. 25 Feb. 2022, doi:10.3390/ijms23052571
1. 该研究评估了对转移性去势抵抗性PC (mCRPC)患者的CTCs和cfDNA进行细胞和分子分析以及CT扫描的放射组学无创分析的可行性。
2. 对22名患者的CTC计数，染色以检测PC相关标记物，并基于形态测量和免疫荧光特征使用机器学习进行聚类，对单个CTC、对应的cfDNA和buffer coats的DNA进行目标区域测序，检测到PC相关基因共享和特有的体细胞变异。对同一患者在CT扫描中发现的骨转移进行放射组学分析，发现了一个与CTC计数和血浆cfDNA水平高度相关的特征。
3. 以多参数方法整合细胞、分子和放射学数据是可行的，可以产生互补信息，使更全面的非侵入性疾病建模和预测成为可能。
传统的组织活检在晚期转移性疾病[1]中的应用有限，这促使该领域考虑替代诊断工具，如放射组学[2]和液体活检[3]。这些技术具有可重复性、非侵入性或微创性，并有望发现预后生物标志物，只需一次抽血，即可对循环肿瘤细胞(CTCs)、细胞游离DNA和RNA、胚系DNA和细胞外囊泡进行表征。虽然单独分析液体活检成分获得了重要的见解，但迄今为止，很少有研究试图直接比较从循环细胞中获得的基因组信息与从同一血液样本中获得的细胞游离物质。这些研究对于确定哪些分析物提供了最相关的疾病和临床可操作的信息是至关重要的。此外，整合来自多个液体活检组件的信息，有可能产生更全面、更准确的进化疾病的分子特征，并最终获得更有效的生物标志物来指导治疗。另一个辅助的、非侵入性的方法监测晚期前列腺癌的治疗是放射组学成像分析的新兴领域。放射组学分析是从标准医疗成像(如CT)中提取定量成像特征。在前列腺癌中，也开始研究这些放射组学特征与预后生物标志物之间的关系，目的是利用成像生物标志物补充基因检测。
该研究在晚期前列腺癌患者队列中，评估了一种多参数、非侵入性分析方法的可行性，该方法整合了液体活检读出CTC计数、CTC Arv7和SYP染色、单个CTC和对应血浆cfDNA的基因组分析、CTC聚类分析，并结合骨转移伴发CT的综合放射学分析。研究目的是评估是否可以使用RareCyte公司的CTC表征技术和相同的靶向测序获得所描述的液体活检读数，从而可以直接比较cfDNA和CTC变异。此外，评估基于CT的无创放射学分析如何与对应患者的CTC和cfDNA读数相关。
研究结果
1. CTC计数和免疫荧光定量
图1 多参数液体活检工作流程。(A).抽取外周血被分离成血浆和单核细胞成分，从血浆中提取cf-DNA，CTC和WBC是通过免疫荧光染色和自动化高含量成像鉴别出来的，单细胞被检索用于提取DNA，血浆和单细胞来源的核酸用来生成扩增子文库测序。对匹配的CT扫描进行图像分割、ROI定义、特征提取和统计分析。(B).本研究中患者、样本和工作流程的配对图。
图2 (A).CTC计数显示为Cell Search和 Rarecyte计数的比较；(B)具有代表性标记物阳性/阴性成像；(C).12例前列腺癌患者的284例CTC的ARv7 MFI分布；(D).12例前列腺癌患者284例CTC的SYP MFI分布;(E).12例前列腺癌患者的284例CTC中SYP与ARv7 MFI的分布情况。
第二管血样用于Arv7单独或联合SYP的定量免疫荧光表征(图2B)。共分析12例患者的284例CTC；≥1例Arv7+ CTC的患者有4例(33%)，≥1例SYP + CTC的患者有5例(42%)，其中3例同时存在Arv7+和SYP+CTC。Arv7、细胞角蛋白(CK)和SYP MFI分布在每个受试者的个体CTC中是高度可变的，表明患者内部存在大量异质性。值得注意的是，在分析的284个CTC中，Arv7和SYP似乎是相互排斥的，两者只有1个CTC阳性。
2. 配对CTC和cfDNA靶向扩增子测序
使用RareCyte的集成Cytepicker模块，15名有CTCs的受试者成功回收了单个CTC(每个样本回收的CTCs范围为1-4个)。共分离37个独立CTC和30个白细胞(WBC)作为胚系对照。所有CTC和WBC单细胞DNA (scDNA)样本，对应cfDNA，和buffer coat DNA (bcDNA)进行文库生成并测序。
图3 液体活检标本测序结果汇总。(A).在cfDNA和CTC中使用胚系突变检测估计变异检出敏感性和阳性预测值。(B).在患者队列中检测cfDNA和CTC的体细胞变异。(C).基因水平拷贝数(CN)估计在cfDNA和CTC中的分布，拷贝数变异分别列示。
在cfDNA和CTC中，常见的前列腺癌相关基因包括AR、TP53、PIK3CA、ALK和PTEN中发现了变异(图3B)。在所有患者cfDNA中共检测到16个sSNV;而在所有患者的CTC中发现了38个sSNV。在所有患者的CTC中观察到的体细胞变异的数量从0到11，其中大多数变异仅在一个CTC中发现，这可能表明CTC变异之间存在高度的异质性(尽管在少数患者中)。类似地，虽然一些突变在配对CTC scDNA和cfDNA的受试者之间是一致的，但大多数突变是截然不同的(图3B)。
在常见的前列腺相关基因中发现了拷贝数扩增，最突出的是AR，其次是ARAF、FGFR1和CDK6。在6例患者中，cfDNA(范围5.3-32.0拷贝)和CTCs(4.4-43.5拷贝)中均发现AR拷贝数增加，受试者配对cfDNA和CTCs之间以及CTC和CTC之间的CN检出具有高度一致性(图3C)。
3. 聚类分析
通过使用形态学特征预测K-means机器学习识别的聚类CTCs个数和预测准确度(灵敏度/特异性)。在患者水平，分析个体内某一簇下的细胞计数百分比与总CTC数和cfDNA水平之间的相关性。
图4 聚类分析结果。第一种方法利用PCA简化的特征集确定为8个聚类(86/400)；第二种使用了11种分类中指定的单一特征，这些特征捕获了核、细胞角蛋白和细胞形状和纹理特征的混合物，进行及其学习发现2个集群。
4. 放射组学和液体活检读数之间的联系
图5 热图描述了每个放射组和分子特征之间的关联模式。
在这里发现具有高放射学异质性的患者与高CTC计数、血浆cfDNA水平和CTC形态相关，以独特的群集为代表。
图6个体患者的多参数剖面：A. 单个mPC患者的液体活检结果总结。B.对转移性骨病变(圆形ROI)进行放射组学分析。
对液体活检成分的初步分析显示，在CellSearch和RareCyte平台上均发现高浓度cfDNA(血浆中35.3 ng/mL)和高CTC计数，分别鉴定出18个CTC /7.5ml和30个CTC /7.5ml。在RareCyte平台上进一步的CTC表型分析显示，约30%的CTC为Arv7阳性，其中Arv7 CTC表现出广泛的MFI值。没有SYP阳性的CTCs表明有神经内分泌表型。对三个个体的CTC进行sSNV分析，发现AR(所有CTC)、TP53(所有CTC)、KRAS(1个CTC)和CCND3(1个CTC)中存在体细胞变异。TP53和AR最常见的两个改变是在配对的血浆cfDNA样本中发现的。有趣的是，这两个同样的体细胞变异(AR T878A和TP53 D281E)与6个月之前骨转移活检的实体瘤NGS结果一致。此外，在液体活检cfDNA (n = 7.5)、CTCs (n = 5.5、6.0、7.6个拷贝)和实体肿瘤NGS中，发现AR扩增的拷贝数具有显著的一致性。其他癌症相关基因如CTC中的ARAF、SF3B1和cfDNA中的KIT也有扩增。放射组学分析显示，该患者骨转移瘤的熵值、对比度、偏度和峰度分别为1.91、1.88、−1.98和8.6，考虑到整个研究样本的分布，熵值、对比度和峰度较高，偏度较低。较高的熵值、对比度和峰度值和较低的偏度值与该ROI的灰度水平的高度异质性相关，并构成与较高的CTC计数和cfDNA水平相关的特征模式。
在这项研究中，以多参数方法整合细胞、分子和放射学数据，将使更全面的复合疾病监测模型预测治疗反应、疾病进展和总生存期。
参考文献：
1. Liu, Zihao et al. “Application of metastatic biopsy based on "When, Who, Why, Where, How (4W1H)" principle in diagnosis and treatment of metastatic castration-resistance prostate cancer.” Translational andrology and urology vol. 10,4 (2021): 1723-1733. doi:10.21037/tau-21-23
2. Ferro, Matteo et al. “Prostate Cancer Radiogenomics-From Imaging to Molecular Characterization.” International journal of molecular sciences vol. 22,18 9971. 15 Sep. 2021, doi:10.3390/ijms22189971
3. Lu, Yi-Tsung et al. “Current status of liquid biopsies for the detection and management of prostate cancer.” Cancer management and research vol. 11 5271-5291. 6 Jun. 2019, doi:10.2147/CMAR.S170380
4. Morrison, Gareth et al. “Non-Invasive Profiling of Advanced Prostate Cancer via Multi-Parametric Liquid Biopsy and Radiomic Analysis.” International journal of molecular sciences vol. 23,5 2571. 25 Feb. 2022, doi:10.3390/ijms23052571
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