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——已知自噬抑制铁死亡，糖酵解抑制铁死亡。

——请回答：自噬与糖酵解的关系。


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我们一起来看篇 16 分的文章
 

题目：Regulation of glycolytic metabolism by autophagy in liver cancer involves selective autophagic degradation of HK2 (hexokinase 2)

译：HK2 的选择性自噬参与调节肝癌细胞的糖酵解水平

影响因子：16.016；分区：Q1 区

全文链接，有需自取：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28980855/


 

全文总结：

本文利用具有基础或受损自噬能力的癌细胞，证明癌细胞的糖酵解活性与自噬水平呈负相关。作者发现，自噬可以通过降解 HK2（己糖激酶 2，一种催化葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸的关键糖酵解酶）来调节细胞糖酵解能力。

What's New：

1. 选择性的 HK2 自噬降解抑制肝癌细胞糖酵解。

2. E3 泛素化连接酶 TRAF6 促进 HK2 的泛素化。

3. 泛素化的 HK2 可被自噬底物 SQSTM1 识别并被进入选择性自噬降解过程

正文内容
 

首先作者确定了自噬和糖酵解之间的关系，引入了自噬激活剂雷帕霉素（RAPA）和自噬抑制剂巴菲尔霉素（BafA1），来研究自噬通量。图 1A 的结果可以看出 BafA1 处理促进了葡萄糖消耗和乳酸的产生，而雷柏霉素处理则抑制了葡萄糖消耗及乳酸的产生。

为了进一步阐明自噬在糖酵解中的作用，作者引入 ATG5 和 ATG7 这两个自噬相关的基因，都进行了这两个基因的敲除处理，图 1B、C 的结果可以看出敲除 ATG5 和 7，葡萄糖的消耗和乳酸的产生增加了。表明自噬受损的细胞获得了更高的糖酵解表型。图 1D 中作者又检测了胞外酸化率（ECAR）。可以看出与对照组相比，自噬相关基因敲除后细胞的糖酵解活性增加。

FIG1 中作者已经证明了，自噬与糖酵解之间的关系，那么接下来就是要验证糖酵解途径中的哪些蛋白受到自噬的影响，作者检测了 5 种酶，发现 ATG5 的敲除增加了 HK2 的水平，但不影响其他酶的表达水平。

为了验证 HK2 在控制糖酵解中的作用，作者用 siRNA 感染了 HK2 的表达，可以从图 2B 看出 HK2 水平的降低导致乳酸产量和葡萄糖消耗显著减少。作者接下来推断通过自噬来调节糖酵解需要 HK2。从图 2C 可以看出，干扰了 HK2 的组，加自噬激活剂和自噬抑制剂，葡萄糖的消耗和乳酸的产生的影响变小了。作者又再次把 HK2 的质粒重新导入到 HK2 干扰组中，可以观察到自噬的抑制剂和激活剂的效果又有明显的效果了。

为了进一步揭示 HK2 在自噬中调节糖酵解的潜在作用，作者设置了一个敲除 ATG5 和干扰 HK2 的细胞分组，检测其糖酵解的能力。图2E 的结果表明，糖酵解的能力下降。图 2F，重新转入 HK2 质粒后，又恢复了糖酵解的能力。



接下来作者为了确定自噬缺陷细胞中 HK2 蛋白水平的增加，是在转录水平发生的还是蛋白质稳定性上发生的。图 3A、B 检测了 mRNA 的水平，可以看出自噬不会在转录水平上影响 HK2。

图 3C 自噬激活剂雷柏霉素和自噬抑制剂巴菲尔霉素分别下调和上调了 HK2 的表达。为了直接检测自噬对 HK2 蛋白降解的影响，图 3D，作者直接用环己亚胺（CHX），可以看出阻断了 ATG5 和 ATG7 的蛋白表达，sh-cont 的 HK2 的蛋白水平急剧下降，sh-ATG5、7 降解速度较慢。

接下来为了确定 HK2 是如何通过自噬降解的，需确定 HK2 的自噬受体。图 3e 的 WB 检测可以看出干扰 SQSTM1 的细胞跟对照组比 HK2 水平是明显上调的。接下来作者通过免疫沉淀检测 HK2 和 SQSTM1 的结合能力，HK2 与野生型的 SQSTM1 是结合的，但是与 UBA 结构域缺乏的 SQSTM1 不结合。这里确定了 HK2 是通过被自噬受体 SQSTM1 识别而被选择性自噬降解的。



因为哺乳动物自噬靶向信号是普遍泛素化的。接下来作者为了确定 HK2 和 SQSTM1 的相互作用是否与泛素化有关。首先在图 4A 中进行了免疫共沉淀，发现是有泛素化表达的，且巴菲尔霉素（Baf A1）处理后泛素化程度更高。从图 4B 可以看出突变 K63R，会损耗 HK2 的多聚泛素化。同时图 4C 的免疫共沉淀结果可以看出，巴菲尔霉素（Baf A1）处理或者是 MG132 抑制剂又或是敲除 ATG5，泛素化程度都会有不同程度的积累。具有赖氨酸 63（K63）连接的多泛素链的 HK2 可能是自噬依赖性降解的靶标。

作者需确定 HK2 是潜在 E3 连接酶候选者。图 4D，是 siRNA 分别干扰了 5 种常见的连接酶，结果只有干扰了 TRAF6 会降低 HK2 的泛素化。在图 4E 中可以检测到内源性 HK2 与 TRAF6 存在相互作用。然后作者研究了 TRAF6 酶活性在 HK2 泛素化中的功能意义。在野生型 TRAF6 存在下，发现 HK2 泛素化显著上调，所以 TEAF6 可能是泛素化 HK2 的主要 E3 连接酶。



接下来的 FIG.5，作者主要是想确定 HK2 中的哪些氨基酸残基可能是针对 HK2 进行自噬降解的主要泛素化位点。通过文献首先确定了负责 TRAF6 介导的泛素化的 HK2 结构域由 2 个域组成，它的催化活性与 C 末端有关，其调节功能与 N 末端有关，两个结构域的分子量为 50kDa。为此作者构建了，截短 N 端，截短 C 端，全长和空白对照，可以从 B 图看出 N 端的泛素化远高于 C 端。图 C 可以看出 TRAF6 的表达增加了 HK2-N 端的泛素化，而 C 端的并不明显。因此，HK2 的泛素化位点在功能上位于 N-末端结构域。

随后用 MS 鉴定泛素化位点，共发现 4 个赖氨酸残基是潜在的泛素化位点，Lys41 是一个位于 N-末端结构域的赖氨酸残基（图 5D）。为了进一步确定 Lys41 对 HK2 降解的影响，作者构建了只含 41 这个位点的 aa 残基去替代 HK2，发现并不能促进泛素化。图 5F 加入 CHX（环己亚胺），K41R 比野生型 HK2 更稳定。



作者之前的研究表明 SQSTM1 的功能主要是运送多泛素化的蛋白质和细胞器进行自噬降解。SQSTM1 也是自噬的选择性底物之一。与自噬通量的干扰减弱了 SQSTM1 的降解。检测自噬的常用方法之一是检测 MAP1LC3B-Ⅱ（微管相关蛋白 1 轻链 3-1 脂化产物）。这个蛋白通常被用作自噬小体的标签，被用来检测自噬。

首先需验证 HK2 的表达与 SQSTM1 或 MAP1LC3B 之前的相关性。图 6A 的 WB 结果显示，HK2 的表达升高伴随着 SQSTM1 表达的增加和 LC3B 表达的降低。B 图可以看出 HK2 与 SQSTM1 呈正相关，与 LC3B 呈负相关。图 C 观察到 HK2 和 TRAF6 呈现很强的负相关。最后评估了 HK2 和 SQSTM1 的表达对疾病预后的影响。HK2 和 SQSTM1 双重阳性的肿瘤患者的总生存期显著短于 HK2 或 SQSTM1 阳性的患者（图 6D）结果表明，作为自噬依赖性降解的底物，HK2 与 MAP1LC3B 和 TRAF6 呈负相关，与 SQSTM1 呈正相关，并且预后不良的肝癌患者 HK2 和 SQSTM1 的表达水平上调。
 

由于证实了糖酵解对自噬受损的肝癌的促进作用，推测抑制 HK2 可能是一种治疗自噬受损的肝癌的关键和临床可行的治疗方法。为了测试这种可能性，在体外检测了 HK2 对自噬受损肿瘤的药理抑制作用。3-溴丙.酮酸 (3-BrPA)、2-脱氧-D-葡萄糖 (2-DG) 和氯硝胺，3 种不同的化合物都是 HK2 的抑制剂。可观察到，与对照组相比，3-BrPA 对 ATG5 基因敲除细胞的增殖有明显的抑制作用 (图 7A)。同样，在 ATG5 基因敲除细胞中，2DG 或氯硝胺处理导致的细胞活力下降比对照组更大。这一发现表明，ATG5 基因敲除使细胞更容易受到 HK2 抑制。图 B、C 可以看出，敲降了 ATG5 同时加了 3-BrPA 抑制剂的瘤子是最小的，进一步证明了自噬受损对肿瘤有抑制作用。通过免疫组化（图 D）结果分析，检测指标是 Ki67，检测细胞增殖的标志。3-BrPA 治疗后自噬受损的肿瘤增殖能力低于对照组。自噬受损的肿瘤细胞对 HK2 抑制更敏感。
 

研究结论：

HK2 蛋白在 Lys41 位被 E3 连接酶 TRAF6 泛素化。泛素化的 HK2 蛋白随后被自噬受体 SQSTM1 识别，进行选择性降解，从而促进对肝癌细胞糖酵解水平的负调控作用。
 

情况一：自噬水平高的肝癌细胞，与患者的低生存期有关。

情况二：HK2 水平高的肝癌细胞，也与患者的低生存期有关。

情况三：自噬和 HK2 水平均较高的肝癌细胞，患者的低生存期更为显著。

情况四：自噬抑制，但人为高表达 HK2，仍可促进肝癌恶性进程。

情况五：自噬抑制，但人为抑制 HK2，则可显著抑制肝癌恶性进程。

 

总结：对于肝癌患者，自噬水平高，不好；糖酵解水平高，也不好。这两个敌人之间是此消彼长的关系，必须都干掉，才好。