背景
mRNA 疫苗是利用外源靶抗原的基因序列通过转录、合成等工艺制备成 mRNA，利用特定的递送系统将其输入细胞，利用体内自身的翻译系统表达目的蛋白，刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护的一种核酸制剂。目前应用的 mRNA 疫苗主要有两种形式, 根据结构可以分为非复制 (Non-replicating) mRNA 和自扩增 (Self-amplifying) mRNA。除编码抗原蛋白的完整 mRNA 外，非复制 mRNA 疫苗的关键组件有：5』帽结构（Cap）、5』和 3』非翻译区（Untranslated Region, UTR）、开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）和 3』 Poly (A) 尾。非复制 mRNA 疫苗优点是结构简单、RNA 序列短、不编码其他蛋白，但其在体内半衰期短、抗原表达量低，需要较高的量才能诱发有效的免疫应答。
图 1. 非复制 mRNA 结构图
自扩增 mRNA 一般是基于病毒基因组改造而来，在非复制 mRNA 序列基础上加了一段 RNA 依赖的 RNA 聚合酶复合物序列，利用病毒的复制机制使该 mRNA 在细胞内自主扩增，从而很少的量就可以诱发有效的免疫应答。
图 2. 自扩增 mRNA 结构图
mRNA 疫苗的特点：1. 不会整合到基因组，具有高生物安全性；2. 仅具有瞬时活性，毒性低；3. 研发周期短，设备要求低，能够实现快速、大规模生产。
mRNA 疫苗制作流程
图 3. mRNA 研发简易流程图
模板设计
通过测序、文献等手段了解靶抗原的基因序列、氨基酸序列和蛋白序列等基础信息，筛选抗原靶标。在转录模板水平上对 mRNA 的序列进行设计和优化（如 GC 含量优化、加入信号肽、插入核苷酸序列等），以提高 mRNA 的稳定性、蛋白的翻译效率，降低 mRNA 的先天免疫水平。质粒构建
通过 PCR 或者直接化学合成等手段获得经优化后的靶抗原 DNA 序列，将其插入质粒载体，构建用于 mRNA 疫苗生产的重组质粒。将重组质粒转化至大肠杆菌工程菌，通过大肠杆菌发酵扩增 DNA。为了方便大家的选择，碧云天特意设计了 T7、SP6 和 T3 不同启动子组合的质粒。
体外转录
mRNA 疫苗的生产是以质粒为模板，在 T7、SP6 或 T3 RNA 聚合酶的作用下，加上对应的底物和缓冲液通过体外转录成初级 mRNA。碧云天生产的 High Yield Transcription Kit，即高产量 RNA 转录试剂盒，能在相对较短时间内进行体外 RNA 大量转录。
产品特点：
▶ 产品种类丰富：有 T7 RNA Polymerase 和 SP6 RNA Polymerase 进行 RNA 大量转录试剂盒可供选择；
▶ 产物产量高：能在相对较短时间内进行体外 RNA 大量转录，使用 1 μg 的模板，在 20μl 的反应体系中反应 2 小时，T7 High Yield Transcription Kit 可产生多达 150-200 μg 的 RNA，SP6 High Yield Transcription Kit 可以产生多达 80-100 μg 的 RNA；
▶ 兼容性强：对于长链和短链的 RNA 都有很好的转录效果。也可转录合成带有 m1ψ 等修饰的 mRNA 或生物素、FITC、Cy3 等标记的 RNA 探针；；
产品效果：
图 4. 碧云天的 T7 High Yield Transcription Kit 以带有 T7 Promoter 的线性化质粒 DNA 为模板进行转录时的产量参考图。
图 5. 碧云天的 T7 Quick High Yield Transcription Kit 以带有 T7 Promoter 的线性化质粒 DNA 为模板进行转录时的产量参考图。
图 6. 碧云天的 SP6 High Yield Transcription Kit 以带有 SP6 Promoter 的线性化质粒 DNA 为模板进行转录时的产量参考图。
相关产品信息：
体外转录一体化试剂盒
为了满足客户个体化需求，客户也可以选择以下单个及组合体外转录原料进行实验
体外转录用酶
体外转录原料
防止 RNA 降解
| 货号 | 名称 | 规格 |
| R0102-2kU | RNase Inhibitor | 2000U |
| R0102-10kU | RNase Inhibitor | 10000U |
| R0102-50kU | RNase Inhibitor | 50000U |
| R0107 | 氧钒核糖核苷复合物(RNase抑制剂) | 2ml |
| R0108 | 氧钒核糖核苷复合物(RNase抑制剂) | 10ml |
去除 DNA 模板
| 货号 | 名称 | 规格 |
| D7073 | DNase I | 200U |
| D7076 | DNase I | 1000U |
mRNA 修饰
为了保证 mRNA 的稳定性和翻译效率，还需要对 mRNA 进行必要的修饰如：加帽、加尾等。碧云天生产的 E. coli Poly(A) Polymerase（R7070），即 E. coli Poly(A) 聚合酶，能以不依赖于模板的方式催化由 ATP 转化成的 AMP 添加到单链 RNA 的 3' 末端，以形成 Poly(A) 尾。E. coli Poly(A) 聚合酶能以各种单链 RNA 作为底物 RNA，实测 15nt 合成的 RNA 完全可以作为 E. coli Poly(A) Polymerase 的底物，在 ATP 存在时催化形成 Poly(A) 尾的。
基于 E.coli Poly(A) Polymerase 活性，碧云天特别研发了 Poly(A) Polymerase Tailing Kit，即 Poly(A) 聚合酶加尾试剂盒，试剂盒提供了加尾所需的各种试剂，方便快捷。
图 7. 碧云天生产的 E. coli Poly(A) Polymerase 与同类产品 (Competitor) 对单链 RNA 加 Poly(A) 尾的对比效果图。在 20µl 反应体系 (50 mM Tris-HCl, pH8.1, 250 mM NaCl, 1 mM ATP, 10 mM MgCl2) 中，加入人工合成的 0.5 µg 22nt 的单链 RNA，以及图中指定量的本产品或 N 公司 (Competitor) 的 E. coli Poly(A) Polymerase，37℃ 孵育 30 min，65℃ 孵育 20 min 终止反应。取出 5μl 反应后的产物，加入 1μl 6X DNA Loading Buffer (D0071)，95℃ 变性 3 min，然后进行含 7M Urea 的 15% 聚丙烯. 酰胺凝胶电泳。室温条件下用 1X TBE 作为电泳液，180V 电泳 90 min，NA-Red (D0128) 1:1000 稀释后室温染色 30 min，然后拍照观察。如图所示，本产品与 N 公司的产品相比，具有类似的对单链 RNA 加 Poly(A) 尾的效果。
相关产品：
| 货号 | 名称 | 规格 |
| R7070S | E.coli Poly(A) Polymerase | 100U |
| R7070M | E.coli Poly(A) Polymerase | 500U |
| R7070L | E.coli Poly(A) Polymerase | 2.5kU |
| R7070XL | E.coli Poly(A) Polymerase | 10kU |
| R7075S | Poly(A) Polymerase Tailing Kit | 50-250次 |
纯化
通常，RNA 转录产物的小量制备可以通过酚/氯. 仿抽提和乙醇沉淀或使用柱纯化的方法进行纯化。对于 RNA 大量制备的情况，色谱柱通常会更加便捷。对于需要精确控制转录产物长度的情况，建议使用凝胶电泳和切胶回收纯化的方法。采用凝胶过滤这样的柱纯化的方法，也可以实现对转录产物长度的控制。拓展
环状 RNA 疫苗
在自然界中，环状 RNA（circRNA）普遍存在于真菌、植物、昆虫、鱼类和哺乳动物，甚至某些病毒的基因组本身就是环状 RNA。相比于线性 RNA，circRNA 可以免受核酸外切酶介导的降解作用，半衰期长，稳定性高；此外，circRNA 还可避免诱发 TLR/RIG-I 介导的免疫反应，更不容易产生副反应，同时 circRNA 无需使用昂贵的修饰核苷酸，有望大大降低 mRNA 疫苗的成本。
碧云天生产的 Circular RNA Synthesis Kit （R0772）是一种便捷高效的利用 RNA 环化酶 (RNA Cyclase) 将 5』磷酸化 3』羟基化的单链 RNA (ssRNA) 转化成 circRNA 的试剂盒。合成的 circRNA 可以用于转染细胞研究 circRNA 的生物学功能等，也可以用作 mRNA 疫苗研究。
产品优势：
1. 环化效率高：本试剂盒能将 95% 以上的 5』磷酸化 3』羟基的单链 RNA (ssRNA) 转化成环状 RNA，环化产物可以不需要切胶纯化，仅需热失活环化酶后通过乙醇沉淀即可用于后续实验。
2. 操作便捷：操作仅需一步孵育即可完成，方便快捷。
图 8. 使用碧云天生产的 Circular RNA Synthesis Kit 制备环状 RNA (circular RNA, circRNA) 的效果图。反应体系为 20μl，单链 RNA 的终浓度为 0.5μM，反应条件为 37°C 孵育 30 min，反应完毕后在 65°C 孵育 15 min 终止反应，随后取样用 15% 尿素 (7M) 变性聚丙烯. 酰胺凝胶在冰水浴中进行电泳，最终进行核酸染色和荧光成像分析。如图所示，本试剂盒在 30 min 内就可以将 95% 以上的 5』磷酸化 3』羟基的单链 RNA 转化为环状 RNA。
| 货号 | 名称 | 规格 |
| R0722S | Circular RNA Synthesis Kit | 20次 |
| R0722M | Circular RNA Synthesis Kit | 100次 |
环形 RNA 合成技术服务
客户只需要提供序列，我们可以提供从 RNA 合成到环化的一站式服务；也接受客户提供的线性 RNA 产物，我们提供后续环化服务；
同时碧云天也提供工业级的疫苗研发用环形 mRNA 合成服务。
如有需要，欢迎咨询合作：
技术服务热线：400-168-3301 转 6 号键
QQ 咨询：4001683301 点击碧云悦助 (外包)
邮箱咨询：service@beyotime.com
常见问题
1.长链RNA转录产物的产量明显偏低。
如果转录产物是长链RNA (>0.3kb))，但其产量明显低于预期，则可能是DNA模板里包含的污染物抑制了RNA聚合酶的活性，或是DNA模板的浓度不正确，或者是DNA模板的3’端为3’突出的末端。
可以尝试以下方案解决：重新纯化DNA模板，建议用酚/氯.仿抽提，并确保把残留的酚去除干净；对模板的浓度以及完整性进行确定；延长37℃反应时间；增加模板的用量；尝试T3或SP6启动子和相应的RNA聚合酶；排除DNA模板的3’端为3’突出的末端。
2.短链转录产物产量明显偏低。
短链转录产物(<0.3kb)可以通过增加反应时间和增加模板的量来提高产量。反应时间可以延长至16小时或者使用2μg以上的模板将会有助于获得更多的转录产物。此外，线性化使用的内切酶需要确保不会产生3’端为3’突出的末端，这样很可能会导致转录产物的产量明显降低。
3.RNA转录产物出现明显降解。
如果RNA在变性的琼脂糖凝胶或聚丙烯.酰胺凝胶电泳时发现有明显的降解现象，提示DNA模板或操作过程中可能被RNase污染了。被RNase污染的DNA模板会影响合成的RNA的长度和产量，导致长度变短和产量下降。如果模板DNA被RNase污染，需要对模板DNA进行酚/氯.仿抽提，然后用乙醇沉淀，最后将DNA溶解于Nuclease-free Water中。同时操作过程中需要严格按照RNA的操作要求进行，避免RNase污染。个别情况也会出现DNA模板降解的情况，此时需要通过电泳分析排除相应的可能性。
4.出现比预期更长的RNA转录产物。
如果在变性凝胶中出现比预期更长的RNA转录产物，很可能是质粒DNA模板未被完全线性化。即使是很小量的未被充分消化的环状质粒，也能产生大量的长转录产物。转录反应前需检查模板DNA是否被充分线性化，如果确认含未线性化的质粒，需要再次进行限制性内切酶消化直至充分线性化，或者进行凝胶电泳切胶回收线性化的模板DNA。当RNA转录产物由于存在较强的二级结构而变性不充分时，也可能观察到较大的条带。
5.出现比预期更短的RNA转录产物。
如果在变性凝胶电泳时观察到比预期更短的RNA转录产物，可能是由于RNA转录酶过早终止。一些类似于T7 RNA Polymerase终止信号的序列会导致RNA转录反应的提前终止。可以通过降低转录温度(如30℃)以增加长转录产物的比例，但总产量会降低。对于富含GC或有二级结构的模板，在42℃下孵育会增加长转录产物的产量。当RNA转录产物由于存在较强的二级结构而变性不充分时，也可能观察到较短的条带。
如果转录产物是长链RNA (>0.3kb))，但其产量明显低于预期，则可能是DNA模板里包含的污染物抑制了RNA聚合酶的活性，或是DNA模板的浓度不正确，或者是DNA模板的3’端为3’突出的末端。
可以尝试以下方案解决：重新纯化DNA模板，建议用酚/氯.仿抽提，并确保把残留的酚去除干净；对模板的浓度以及完整性进行确定；延长37℃反应时间；增加模板的用量；尝试T3或SP6启动子和相应的RNA聚合酶；排除DNA模板的3’端为3’突出的末端。
2.短链转录产物产量明显偏低。
短链转录产物(<0.3kb)可以通过增加反应时间和增加模板的量来提高产量。反应时间可以延长至16小时或者使用2μg以上的模板将会有助于获得更多的转录产物。此外，线性化使用的内切酶需要确保不会产生3’端为3’突出的末端，这样很可能会导致转录产物的产量明显降低。
3.RNA转录产物出现明显降解。
如果RNA在变性的琼脂糖凝胶或聚丙烯.酰胺凝胶电泳时发现有明显的降解现象，提示DNA模板或操作过程中可能被RNase污染了。被RNase污染的DNA模板会影响合成的RNA的长度和产量，导致长度变短和产量下降。如果模板DNA被RNase污染，需要对模板DNA进行酚/氯.仿抽提，然后用乙醇沉淀，最后将DNA溶解于Nuclease-free Water中。同时操作过程中需要严格按照RNA的操作要求进行，避免RNase污染。个别情况也会出现DNA模板降解的情况，此时需要通过电泳分析排除相应的可能性。
4.出现比预期更长的RNA转录产物。
如果在变性凝胶中出现比预期更长的RNA转录产物，很可能是质粒DNA模板未被完全线性化。即使是很小量的未被充分消化的环状质粒，也能产生大量的长转录产物。转录反应前需检查模板DNA是否被充分线性化，如果确认含未线性化的质粒，需要再次进行限制性内切酶消化直至充分线性化，或者进行凝胶电泳切胶回收线性化的模板DNA。当RNA转录产物由于存在较强的二级结构而变性不充分时，也可能观察到较大的条带。
5.出现比预期更短的RNA转录产物。
如果在变性凝胶电泳时观察到比预期更短的RNA转录产物，可能是由于RNA转录酶过早终止。一些类似于T7 RNA Polymerase终止信号的序列会导致RNA转录反应的提前终止。可以通过降低转录温度(如30℃)以增加长转录产物的比例，但总产量会降低。对于富含GC或有二级结构的模板，在42℃下孵育会增加长转录产物的产量。当RNA转录产物由于存在较强的二级结构而变性不充分时，也可能观察到较短的条带。
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