涂片及染色是微生物学的基本技术，也是观察细菌最简单且行之有效的方法。通常情况下，由于细菌个体较小，较透明或半透明，如未经染色往往不以观察识别。因此借助于染色法可以使细菌着色，与视野背景形成鲜明对比，从而易于在显微镜下进行观察。

常见的染色方法包括简单染色、负染色、革兰氏染色、芽孢染色法、鞭毛染色、荚膜染色、死活染色。制备细菌染色片一般要经过涂片、固定、染色、水洗、干燥等步骤，然后用显微镜甚至油镜观察。

1、简单染色

不同细菌或者由于观察者所侧重观察的内容不同，所以使用的染料也有差异，但是简单染色的方法是一样的。先按照上述的制片方法制片，制成需要观察的玻片后，使用相对应的染料滴加到玻片上的菌膜区域，以覆盖菌膜为准。按照不同染料的要求，结合所观察的内容确定染色时间，染色时间到达时，进行水洗，干燥等步骤。最后得到的玻片加盖盖玻片即可进行镜检。如有需要可以后续再进行油封、蜡封等封片过程。



2、负染色

制备观察图片是非常容易的，但是对初学者来说想要在玻片中找到目标菌还是有一定难度的，因为细菌常常无色透明且比较小，所以对初学者来说除非对光圈等进行很精细的调节，否则很难观察到目标菌，因此进行负染色就十分重要。该方法是将微生物与苯胺黑或者 india 墨水混合，再将混合物覆盖于载玻片表面，由于这两种天然黑色染料不能渗入微生物细胞，所以使得透明的微生物个体在黑色的背景下很容易观察。负染色法常见有两种操作方法。

第一种发个方法比较常见，在一个载玻片上将微生物与异地苯胺黑混合，用另外的载玻片将混合物均匀的覆盖于原来的载玻片上。该方法的目的是使混合物在在玻片上一边厚一边薄，在厚与薄中间的额区域就是最佳观察区域。如图所示：



第二种方法是用一接种环苯胺黑与微生物混合，用接种针在载玻片的中央将混合物延伸很小的区域。具体操作如图所示：



3、革兰氏染色

革兰氏染色是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。细菌先经碱性染料结晶紫染色，而后经碘液进行媒染，之后用酒精脱色，在一定条件下有的细菌媒染后的颜色不会脱去，有的可以被脱去，前者叫做革兰氏阳性菌，后者为革兰氏阴性菌。为方便进一步观察，脱色后再用碱性蕃红进行复染，阳性菌仍为紫色，阴性菌染成红色，这就是革兰氏染色的原理。其步骤包括初染、媒染、脱色、复染四个步骤，主要步骤如图所示：



4、芽孢染色法

部分细菌能产生内孢子，这些孢子能抵制细菌染色液的进入，在革兰氏染色法涂片染色时，革兰氏阳性菌的芽孢呈现无色。虽然芽孢在革兰氏染色片中可以看到，但在不易清晰观察时，可用特殊的芽孢染色法，使芽孢与菌体呈现不同颜色，便于观察。主要的芽孢染色法有孔雀绿染色法和石碳酸复红染色法。

4.1、 孔雀绿染色法的具体步骤：

首先将生有芽孢的斜面菌苔按革兰氏染色法涂片后，用饱和孔雀绿水溶液染色10min，然后用自来水冲洗，冲洗完后用0.5%蕃红液复染30s，用水洗，吸干，即可镜检，镜检时芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。

4.2 、石碳酸蕃红染色法具体步骤：

首先按常规涂片，然后滴加石碳酸复红于涂片上，并于玻片下缓缓加热，使染液冒蒸汽但不沸腾，并继续滴加染液，不使涂片上染液蒸干，这样保持 5 min。带涂片冷却后，倾去染液，用酸性乙醇脱色指无红色染剂洗脱为止，接着彻底水洗，洗后用吕氏美蓝复染 2-3 min，水洗吸干后即可进行镜检，镜检时菌体计孢囊呈蓝色，芽孢呈红色。

5、鞭毛染色法

鞭毛是细菌的运动器官，非常纤细，超出了光学显微镜观察极限，因此通常情况下在显微镜下观察不到。通过特殊的染色技术，可以将染色液附加到鞭毛的周围，增加它的直径，从而能在光学显微镜下观察到鞭毛。鞭毛染色一般分银盐法和复红沉淀法两种。这里介绍一下银盐沉淀法。用作鞭毛染色的载玻片必须是绝对干净无油脂的，将载玻片在火焰上快速灼烧 5s，放在染色架上冷却，用蜡笔分成两个区域，然后用移液管或者巴斯德移液管吸取 2 mL 无菌水加入到幼龄生长活跃的斜面菌株中，慢慢震荡并旋转试管使菌株悬浮，尽量避免使用接种环，将悬液转移到干净的试管中，通过悬滴试验检查菌体的运动型，用无菌水将悬浮液稀释至略有浑浊为止，放入 20-30℃ 培养箱中培养 30 min，然后移取一满环悬浮液加在已冷却的载玻片一端，倾斜载玻片让液滴流到蜡笔画的中心线，在空气中自然干燥。然后用媒染色剂媒染 5 min 之后，慢慢用蒸馏水充分漂洗掉所有的媒染液，用热的 Fontana 银盐覆盖，染色 5 min，每隔 1 min 更换一次染色液（Fontana 银液在沸水浴中加热），细菌涂层的每一部分都要浸在染色液中，不能裸露。最有用水冲洗，自然晾干即可进行镜检。应当注意一点，染色法的燃料须当日配制，4 h 内使用，最好是现配现用。

6、荚膜染色

一般细菌的荚膜与染色剂的亲和性低，但荚膜通透性高，因此染料可以透过荚膜使菌体着色。一般采用负染色方法使背景和菌体之间形成一透明区，将菌体衬托出来便于观察分辨。荚膜染色的步骤：加一滴 6% 葡萄糖水溶液在载玻片的一端，无菌操作，挑取细菌斜面上培养 72 h 左右的胶质芽孢杆菌与其混合，加 1 滴墨汁充分混匀，用推片法制片将菌液铺成薄层，自然干燥，滴加 1-2 滴无水乙醇覆盖涂片，固定 1 min，自然干燥，在已晾干的涂面上，滴加 1% 结晶紫染色液染色，2 min 后用 20% 的硫酸铜冲洗数次，再用自来水冲洗一次，使用擦镜纸擦干后即可镜检。有荚膜的菌菌体呈紫色，背景灰黑色，荚膜不着色呈无色透明圈。具体操作过程见下图：



7、死活染色

死活染色排除法是生物研究中判断细胞活性的一种常用方法，是利用死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的，常用的染色剂有台盼蓝和美蓝，前者使用范围较广，后者一般在酵母菌细胞死活鉴定上使用较多。

以上介绍的染色法，基本上涵盖传统微生物实验室能用到的所有的染色法。染色法在细菌的观察、分类、鉴定中经常用到，因此是微生物检测人员不可或缺的基本技能之一。