干血点采样法（dried blood spot，DBS）是一种将全血样品收集在卡纸上的方法，在血样采集方法上干血点采样法比传统方法有一定的优势，它需求的血量样本较少，血样的采集、存储运输更方便，样品的前处理更简化。现在DBS已成为一个重要的血液采集方法，在科学研究中有越来越多的应用。

目前，在皮摩尔水平(即肽在血浆或其他生物基质中发现的浓度)下，开发一种从小到大(5-50 AA长度)、亲水到疏水和两亲性的多肽组学LC-MS分析方法仍然具有挑战性。许多多肽组学处理样品的方法，不利于长肽和疏水肽的测定，例如在提取生物基质的冻干复溶等步骤中易造成稳定性差等问题的出现。

为了解决这一问题，2020年9月瑞士洛桑大学蛋白分析平台以及洛桑大学医院的Bertrand Rochat等人在Talanta上在线发表了题为“Robust and sensitive peptidomics workflow for plasma based on specific extraction, lipid removal, capillary LC setup and multinozzle ESI emitter”的文章，提出了一种新的LC-Newomics M3多通道喷针-高分辨率(HR)MS血浆多肽组学工作流程，与之前的多肽组学方法相比，该工作流程在分析稳健性和灵敏度方面得到了显著的提升。

 

利用此工作流程，研究人员对一名健康志愿者在超过65小时收集的干血斑进行了肽组学研究，发现了5个显示昼夜节律振荡的富酪蛋白片段 (2.9-3.8 KDa)。这是首次在血液中观察到富酪蛋白。该工作流程除了改善血浆基质的检测，还可应用于尿液、唾液、组织匀浆等基质。

M3（Microfabricated Monolithic Multinozzle）喷针为8通道的多通道设计，区别于传统单通道喷针，M3喷针可增强离子化效应，提升灵敏度和稳健性，并且降低基质效应，从而实现Microflow LC到Nanospray MS的体系，另外还具有即插即用，易于操作的优势。

 

实验方法：

1) 实验样本：使用 Hemaspot™-SE 设备在 65 小时内定期收集健康志愿者的干血斑 (DBS)。对志愿者进行了13次采血：第1天：10：00、12：30、16：00、19：30、23：15、3：00、4：30；第2天：7:00、10:30、11:50、3:00； 第3天：3:00。

 

2) LC: Ultimate 3000

3) MS: Q-Exactive Plus

4) 如下图所示，实验对3个ESI源在溶剂或血浆提取物中的纯标准品以10 μL/min的流速进行对比测试：

 

l HESI-II离子源（Thermo Fisher Scientific），带有微针（50 μM内径）喷针

l EASY-Spray 离子源(Thermo Fisher Scientific)，带有20 μM内径二氧化硅喷针

l Newomics M3喷针（Newomics，Berkeley，CA，USA）

      实验结果1：建立了新的血浆多肽组学LC-MS工作流程

研究者提出了新的工作流程，在以下几个方面做出了改进：

1) 用预冷的氯化钠溶液快速稀释全血达到降温和抑制蛋白酶活性的作用

2) 提取前先进行蛋白变性，使所有内源性多肽从蛋白结合中释放出来

3) 固相萃取(SPE)去除大部分蛋白质和脂质，以避免强烈的基质效应及防止其在LC体系中的积累

4) 没有冻干复溶步骤，避免肽损失

5) LC系统中肽段在trap柱上被捕获，过滤器在每次注入后都会用流动相进行反冲洗，提高了系统的稳健性

6) 使用毛细管分析柱(0.3 mm i.d)，灵敏度和稳健性得到了提升

7) 采用多通道ESI离子源（MnESI）改进了肽的检测

8) 采用MS1和MS2采集模式的高分辨率质谱(HRMS)选择性检测肽

  

Fig.1喷针和离子源锥孔位置，以及对MS入口孔堵塞的影响 

首先，如上图所示，研究者观察到喷雾是否对齐对稳健性有很大的影响。

当喷雾直接对准MS入口时，质谱容易发生堵塞。在分析血浆样品时，用EASY-Spray源进行实验观察到了这一点，相比之下，当喷雾方向与MS入口(例如M3多通道喷针或经典HESI-II源)呈显著角度时，在注入100个样品之前没有观察到这种堵塞。纳喷源的角度往往与蛋白质组学分析中注入极其干净的样品相匹配。但常规分析中，样本制备后仍含有一定量的脂质和完整蛋白质，由于这个原因，尽管EASY-Spray带来的灵敏度要高，研究者还是选择放弃了EASY-Spray离子源用于研究。

 

Fig.2比较两种离子源的肽检测，结果表示为M3喷针/HESI-II在血浆提取物中检测肽的峰面积比。图中显示的是10天内进行的10次测定的平均标准差。

如上图显示，研究者对血浆提取物中的10个多肽进行了3天的分析，测量了M3多通道喷针相对于HESI-II源获得的灵敏度提升，结果表明，平均灵敏度提高了24.4倍，最小值为6倍，最大值为60倍。灵敏度提升与电荷状态z呈正相关，但与保留时间无关。 

 

Fig 3 两种离子源的XIC峰图对比

此外，M3多通道喷针也显示出比HESI-II更好的喷雾稳定性和峰宽(-36%)。Hepcidin是一种长度为25个氨基酸的肽，分别使用M3多通道喷针（左）或HESI-II（一种经典的ESI离子源）（右）电离，如图描绘了每个离子源的代表性色谱图。对于z=5和z=4，M3喷针的峰高分别提高37.2倍和16.3倍，峰面积分别提高了25.4倍和11.0倍。M3喷针显示出更好的喷雾稳定性（信号波动更小）和峰宽。

基于上述原因，研究者决定在初步的昼夜多肽研究中使用M3多通道喷针。 

      实验结果2：肽组学工作流程在血浆肽昼夜节律上的应用研究 

研究人员将新的工作流程应用于一个健康志愿者的血浆肽昼夜节律变化的初步研究中。使用Hemaspot^TM -SE系统方便地采集干血点样品。

图4A为Progenesis QI软件处理数据后显示的肽P3821 (z = 4)，显示昼夜节律变化。P3821的萃取离子色谱图和同位素分布如图4B所示。通过对首次LC-HRMS数据采集的严格处理(仅在全扫描采集中执行)，没有其他肽被识别为昼夜节律。图4C为PEAKS Studio软件识别出的序列(ID score，10lgP=69.8；质量精度=1.2 ppm)。P3821是一个32个氨基酸长度的肽段，是人类富酪蛋白的截断形式。四种STATH附加肽在血液中显示昼夜节律振荡。在夜间或白天采集的样本之间的平均峰面积比在3.5到21倍之间，这表明在夜间血液中这5种多肽的含量显著增加。

已知人类唾液中含有丰富的STATH多肽，然而这是第一次在干血点采集的血液中检测到STATH 30-61、33-61、33- 62、30- 56和40- 62肽。还需要进一步研究 STATH肽在血液中的作用以及为什么它们发生昼夜节律。

 

Fig.4 A. P3821的XIC图；B. 肽P3821在65小时昼夜节律周期内变化；C. P3821为人类富酪蛋白的30-61截短型

     研究结论：

     研究者通过系统地重新设计和优化一系列步骤，显著改进了先前用于血浆或其他生物基质的肽组学工作流程。通过更强的在线稀释（≥15 倍）、带有聚合物相的 SPE 去除脂质和其他碎片以及在每个样品之间反吹在线过滤器，可提高重现性和稳健性。全血提取后，用预冷的NaCl溶液快速稀释血液、提取前蛋白质变性、没有冻干复溶步骤和大的进样量(250 μL)是该肽组学工作流程的关键。使用3个LC泵、一个捕集柱和分析柱（1和0.3 mm i. d.)，在每个样品之间增加反冲洗在线过滤器步骤以及使用M3多通道喷针构成了LC-MS系统流程的独特性。此外使用M3多通道喷针，肽检测得到显著改善，能在体内水平定量和发现许多内源性肽。研究者通过多肽组学工作流程使用改进的LC和具有多通道喷针的ESI源提高了检测的稳定性和灵敏性。该方案的应用首次在人类血浆中发现具有昼夜节律振荡的富酪蛋白片段。
   
      目前Newomics公司还推出MnESI（Microflow-nanospray ESI source）离子源，可适配赛默飞和布鲁克质谱。目前搭载的喷针规格有3种：

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