细胞作为生命活动的基本单位，也是咱们生命科学及医学领域最重要的实验材料之一。因此，培养一窝健康生长的细胞 「宝宝」 对咱们科研人员而言，是一门必不可少的入门手艺。
然而做过的人都懂，这细胞培养虽是入门手艺，可一点都不简单呐！分分钟来个污染，尤其是微生物污染，轻则自个儿的细胞废弃，重则连累整个培养箱，甚至培养室！让人头疼不已！
那么究竟有哪些微生物会造成细胞污染呢？我们又该如何应对？今天小 P 就和大家一起总结一下～
微生物污染分类
一、细菌污染
细菌污染是细胞培养中最常见的污染，其污染主要来源于实验室环境、实验人员（实验服）、实验用具等，甚至在细胞培养过程中添加抗菌素（一般为预防剂量），也可能因为操作不慎而引起污染。
种类：造成细菌感染最常见的有革兰氏阳性菌如枯草杆菌、葡萄球菌等；大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌也会造成细菌感染。
特点：细菌污染的培养液通常会出现浑浊、PH 下降，也有少部分会出现培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染情况，建议每天仔细观察；被污染的细胞在显微镜下可以观察到细胞胞浆出现大量颗粒，细胞变圆或者崩溃，从壁上脱落死亡。一般细菌污染进程很快，大约污染一两天后肉眼就能显著观察到变化。
（图片来源于 www.dxy.cn）
二、真菌污染
真菌污染是细胞培养过程中最常见的另一种污染，尤其在霉雨季节，霉菌污染尤为严重。另外由于真菌可以通过孢子繁殖，因此一旦污染很容易发生扩散。
种类：常见的真菌感染有烟曲霉菌、黑曲霉菌、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌污染等。
特点：霉菌污染的细胞培养液短期内一般不会浑浊，可在培养液表面形成白色或黄色漂浮物（斑点状，易于观察）；高倍镜下可见明显的丝状、管状或是树枝状的菌丝纵横交错在细胞间；念珠菌和酵母菌污染一般会成卵圆形散在细胞周边，并且酵母菌污染会导致培养液浑浊。真菌污染会与细胞抢夺营养，还会释放次级代谢物毒害细胞，造成细胞活力变差，生长速度变慢，甚至死亡。
（图片来源于参考文献 3）
三、支原体污染
支原体是一种大小介于细菌和病毒之间，并独立生活的原核微生物，广泛存在于人和动物体内。
种类：细胞培养中常见的支原体有口腔支原体、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体、猪鼻支原体、肺炎支原体和发酵支原体，其中前四者占据支原体污染的绝大比例。
特点：支原体大小为 0.1-0.3 µm，可以轻易通过我们常用于除菌的 0.22 µm 和 0.45 µm 孔径滤膜；并且在常规光学显微镜下无法观察到，荧光显微镜下可用 DAPI 染色观察到支原体污染；此外支原体无细胞壁，可以直接且紧密结合宿主细胞细胞膜，适当条件下可能导致细胞融合。
支原体污染具有隐蔽性，他们可以与细胞长期共存，培养基一般不浑浊。大部分细胞被污染后似乎无明显变化，但其实支原体会抑制细胞生长，并且导致染色体畸变等，对细胞培养实验影响巨大。
（图片来源于 Proteintech）
四、黑胶虫污染
黑胶虫是一种生物还是非生物，学术界至今还有争议。这里我们暂且将其认作是一种微生物。黑胶虫污染主要来源于血清。
特点：黑胶虫污染起初对细胞并无影响，当达到一定数量时则会影响细胞生长。受黑胶虫污染的细胞液通常清亮无变化，在高倍显微镜下可以观察到点状片状的游动小体，做布朗运动。
（图片来源于参考文献 4）
五、病毒污染
病毒作为一种比支原体更小的微生物，体型在 nm 级，很难用常规方法检测到。病毒污染分为外源性和内源性，污染主要来源为细胞系，常见于杂交瘤细胞。
特点：病毒污染的细胞液通常清亮无变化，大部分被污染的细胞也不会产生形态及病理现象，小部分病毒会造成细胞变圆、肿胀、脱落。
病毒污染可用血细胞吸附实验、免疫荧光抗体法以及电子显微镜法检测，但其清除是十分困难的，一旦不幸被污染，建议直接重新引入高质量细胞株。
微生物污染预防
微生物污染在细胞培养中是非常常见的，也是令人头大的一件事情。所以我们一定要将问题扼杀于摇篮之中，规范实验中的各个步骤，确保细胞「宝宝」在无污染的情况下健康成长。
1．实验进行前，准备好所需的试剂和器材。玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒：1) 高压蒸汽灭菌 15 分钟以上；2) 干烤消毒 140℃ 2 小时以上。
2．培养基 (pH7.2) 和血清配制好后要做无菌试验：将血清按 10% 加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基 5-10 ml 置培养箱内培养 2-3 天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置 4℃ 保存。
3．消化液 (pH7.8) 或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置 - 20℃ 保存。
4．超净台用紫外灯照射 30-60 min，并开启超净台风机运转 5-10 min，然后用 75% 酒精擦拭超净台台面，再开始实验操作。
5．实验进行时，佩戴好口罩及手套，穿上洁净实验服，有长发则将长发扎起或者佩戴帽子，避免灰尘或唾液进入培养物中。
6．进入超净台前应用 75% 酒精对双手及手腕进行全面擦拭，确保除菌完全。
7．实验用品用 75% 酒精擦拭后才能放入超净台内。
8．操作时小心取用无菌物品，应避免污染。勿碰触吸管尖头，不小心碰触后应立即更换；手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，容器打开后，倾斜 45 度操作，操作完成后及时盖上瓶盖。
9．每次操作只处理一种细胞；即使不同细胞使用相同的培养基也不要共享同一瓶培养基，避免细胞间的交叉污染。
10．实验用品用完应移出超净台，以利于空气流通；实验完成后用 75% 酒精擦拭超净台台面。
11．定期清洗或更换超净台过滤膜、预滤网。
12．此外 CO2 培养箱的清洁是较易被忽视的地方，应 1-2 个月对培养箱定期进行清洁消毒。先用 75% 酒精擦拭培养箱内壁、隔板、水盘 2-3 次，用双蒸水清洗，再用酒精棉球擦拭一遍，最后紫外灯照射 1 h 以上或进行高温高压灭菌处理。水盘内加入无菌水（应每周更换），待培养箱内温度、湿度、CO2 浓度稳定后再放入细胞。
微生物污染去除
有同学可能会问，细胞已经被污染了怎么办？还能挽救吗？
首先我们要知道，在任何情况下，完全去除细胞中的微生物污染是非常困难的！因为不管是哪一种操作，对细胞的生长而言都是一种额外刺激，很有可能导致细胞状态改变甚至死亡；而过度使用抗生素可能产生更强抗性的菌株，撤药后极易复发。
所以，对于易于重新获得的细胞株，我们建议直接处理培养物，不分敌我全部消灭，防止感染扩散！对于极为珍贵的细胞样本，我们可以尝试以下处理方法进行挽救。
一、细菌、真菌污染处理方法
1. 用 DBSS 洗细胞（稀释污染物）：
(a). 对于单层细胞，用 DBSS 浸洗培养物 3 次，胰蛋白酶消化，通过离心重悬用 DBSS 再洗细胞 2 次；
(b). 对于悬浮细胞，通过离心重悬用 DBSS 洗培养物 5 次。
2. 在新培养瓶以最低可行种植密度再接种。
3. 加入高浓度抗生素培养基，每 2 天换液。（一般在正常工作浓度的 5-10 倍，建议做梯度实验确保对污染物杀伤力较大，对细胞影响较小）
4. 用高浓度抗生素培养基再培养。
5. 重复步骤 1～4，进行 3 次再培养。
6. 去掉抗生素，在无抗生素培养细胞的状况下再进行 3 次再培养。
7. 通过相差显微镜检查培养物并进行 Hoechst 染色。
8. 在无抗生素的条件下再培养细胞 2 个月，检查确定所有污染已被移除。
细胞培养正常抗生素浓度推荐表
（数据源于参考文献 3）
二、支原体污染处理方法
1. 用 D-PBSA 洗涤细胞（稀释可以减少污染物数量）：
(a). 对于单层细胞，用 D-PBSA 浸洗培养物 3 次，胰蛋白酶消化，通过离心重悬用 D-PBSA 再洗细胞 2 次；
(b). 对于悬浮细胞，用 D-PBSA 离心重悬洗涤细胞。
2. 以高种植密度接种 1 个或者多个新培养瓶。
3. 加入高浓度抗生素培养基，每 2 天换液。
4. 用高浓度抗生素培养基再培养，如果不同类型的抗生素与 BM-Cyclin 交替使用，细胞应在应用新抗生素前换液。
5. 去掉抗生素，在无抗生素培养细胞的状况下培养细胞至少 2 周。
6. 用 PCR 或者其他支原体检测方法检测培养物。
7. 在无抗生素的条件下再培养细胞 2 个月，检查确定所有污染已被移除。
支原体去除抗生素浓度推荐表
（数据源于参考文献 3）
三、黑胶虫污染处理方法
上面提到黑胶虫污染主要源于血清，故实验时尽量采用质量和口碑较好的血清培养。 黑胶虫早期污染一般采用如下方法：
1. 用 0.25% 的胰酶消化，当有少量细胞变圆或脱壁时，用血清终止消化；
2. 轻轻用培养液或 D-Hanks 液清洗 3 遍（缓缓流过细胞表面），不要吹打，吹散细胞；
3. 换培养瓶培养，隔天换液，2 天后重复一次；
4. 此后每 24-36 h 换液一次，一周后，黑点基本消失。
上述污染去除方案均是在细胞极其珍贵情况下的无奈之举，在细胞易于获得的情况下还是建议大伙儿直接处理掉污染的细胞，重新以新批次细胞进行试验，不仅节约时间，而且风险更小。
以上就是今天想和大家分享的全部内容，希望对你们有帮助哦 ～
参考文献
1. 陈思瑶，吴亚猛等。细胞培养过程中常见的微生物污染及处理方法 [J]. 吉林医药学院学报，2016.
2. 姜彬。细胞培养技术简介及避免污染的策略 [J]. 生物学通报，2008.
3. R. Lan Freshney 著，章静波，徐存拴，等译。动物细胞培养 —— 基本技术和特殊应用指南（原书第七版）. 科学出版社，2020.
4. 周怡婷，高增鸿等，细胞培养中 「黑胶虫」 污染的检测及防治 [J]. 生物化学与生物物理进展，2019.
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