●前言
2021年5月，西北大学化学与材料科学学院合成与天然功能分子教育部重点实验室申烨华教授课题组在Frontiers in Plant Science期刊发表了题为“Metabolomic and Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) Analyses Reveal the Important Function of Flavonoids in Amygdalus pedunculata Pall Leaves With Temporal Changes 的研究成果，通过非靶向代谢组学（UPLC-QTOF-MS）和CLSM（超高压液相-飞行时间质谱和激光共聚焦）研究方法，发现长柄扁桃叶生长过程中黄酮类化合物的积累特征，探究黄酮类化合物在叶中的积累与果实的发育和成熟的相关性，描绘了代谢组图谱，为长柄扁桃的综合开发提供了理论依据。
中文标题：代谢组学和激光共聚焦显微镜(CLSM)分析揭示长柄扁桃叶生长过程中黄酮类化合物的重要作用
研究对象：长柄扁桃叶
发表期刊：Frontiers in Plant Science
影响因子：5.753
发表时间：2021.5.19
合作发表单位：西北大学化学与材料科学学院合成与天然功能分子教育部重点实验室、陕西林科院，国家林草局长柄扁桃工程技术研究中心，中国林科院林业研究所国家林业局林木培育重点实验室
运用生物技术：代谢组学、激光共聚焦显微镜
●研究背景
长柄扁桃适合沙漠复垦和能适应各种土壤类型和土壤水分条件，对沙漠化控制具有重要的生态意义。野生长柄扁桃种子富含脂类、蛋白质、维生素和矿物质元素，籽油通过改善血浆抗氧化能力和降低血脂水平，防止高脂血症的发生。
长柄扁桃种皮多酚具有抗氧化、抗菌和抗hepg2细胞活性。本研究采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)运用代谢组学对长柄扁桃不同时间的叶片进行分析。结合化学计量学进行代谢组学分析，研究长柄扁桃叶片生长过程中几种生物活性化合物的代谢变化。采用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)对不同时期叶片中黄酮类化合物进行组织定位和定量分析。通过这些分析，阐明了长柄扁桃叶片在生长过程中重要次生代谢产物的变化。
●研究方法
1.实验材料
收集陕西省榆林治沙研究所基地种植的长柄扁桃在开花期、果实形成期、果核期和果实成熟期的叶子；
样品采自开花期(AP1， 2019年4月18日)至果实成熟期(AP6， 2019年7月19日)。
AP2(2019年5月16日)为果实形成阶段。
AP3(2019年6月2日)和AP4(2019年6月17日)样品均处于果实硬核阶段；AP5(2019年7月3日)和AP6(2019年7月19日)样品均处于果实成熟阶段。
2.代谢组学分析
代谢组学分析：使用代谢组学处理软件Progenesis QI v2.3对原始数据进行基线过滤、峰识别、整合、保留时间校正、峰对齐和归一化。使用HMDB， Lipidmaps2、METLIN数据库以及基于精确质量、二次碎片和同位素分布的自建数据库，得到定性数据，并对定性得到的化合物进行筛选。
将数据归一化，采用R ropls包进行模式识别，采用主成分分析(PCA)观察样品间的总体分布和整个分析过程的稳定性。然后使用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)来区分组间代谢谱的总体差异，找出组间的差异代谢物。分析比较两组差异代谢物。
采用共聚焦激光扫描显微术对长柄扁桃叶组织切片进行荧光纤维观察，用488 nm氩离子激光器激发染料分子。采集荧光图像，发射波长分别为500-560和570-630 nm。利用NIS- Elements软件对图像采集参数进行调整和处理。
●研究结果
1.代谢组学分析黄酮类化合物的含量差异
运用LC-MS非靶向代谢组学探索长柄扁桃代谢物在不同时期的变化，使用无监督PCA来反映样本组之间和内部代谢物谱的总体变异性，并观察样本之间的总体分布趋势。
在这些代谢物中，共获得生物活性代谢物274个，其中黄酮169个，有机酸68个，萜类35个，单宁类2个，共274个代谢物(补充表1)。比较AP1和AP3样品，共获得641个差异代谢物，其中上调代谢物334个，下调代谢物307个。比较样品AP1和AP6得到差异代谢物675个，其中上调代谢物280个，下调代谢物395个。
为了了解三组样本之间代谢网络的差异，将差异代谢物提交到KEGG 的代谢途径富集分析网站，10个富集的通路−lg(假定值)值样本AP3、AP6与样本AP1相比，包括三种常见的主要代谢途径(柠檬酸循环(柠檬酸循环)，嘌呤代谢和亚油酸新陈代谢)和两个常见的特殊代谢途径(类黄酮生物合成和黄酮和黄酮醇生物合成)。在AP3/AP1组中，类黄酮生物合成代谢途径排名一，黄酮和黄酮醇生物合成代谢途径排名第八。在AP6/AP1组中，类黄酮生物合成代谢途径仍排在一位，黄酮和黄酮醇生物合成代谢途径排在第四位。这些结果表明，植物花期和结实期的类黄酮和黄酮醇的生物合成途径存在显著差异。（图1）
图1 | AP3与AP1、AP6与AP1的差异代谢物KEGG富集通路分析（仅显示10个富集通路）
2.黄酮类化合物的动态积累
NA染色长柄扁桃叶片在不同时期的横截面在488 nm的激发波长下，黄酮醇和黄酮苷发出绿色和红色荧光。样品在染色前显示叶绿体自身荧光，通过减去背景信号消除这种干扰。叶片横截面激光共聚焦成像显示，海绵状组织和栅栏状组织的荧光强度高于叶片其他组织。气孔两侧保卫细胞和表皮细胞核仁区荧光强度较高。而表皮细胞胞浆内的荧光强度较低，维管束内的荧光强度最低。相对荧光强度在AP3样品中达到峰值，在AP6样品中最小。AP3样品的相对荧光强度是AP6的2.13倍，AP3样品的相对荧光强度是AP1的1.24倍，AP6样品的相对荧光强度是AP1的0.58倍(图2)。
图2 | 黄酮类化合物在不同时期的长柄扁桃叶中的分布（横截面）
●相关讨论
许多活性物质在植物生长发育的不同阶段差异很大。因此，测定不同生长阶段的活性物质含量十分重要。长柄扁桃叶片生物活性物质在不同时间的变化特征尚未研究。在本研究中，作者使用UPLC-MS检测不同时间的代谢物，并使用LC-MS非靶向代谢组学方法对代谢数据集进行统计分析，获得几种生物活性化合物的变化情况。
在研究的几种生物活性差异代谢物中，长柄扁桃叶中黄酮类化合物最为丰富。叶片类黄酮代谢与生长有关时期。与AP6样品相比，AP3样品中黄酮类化合物含量更高。因此，作者推测在果实发育期间，植物对外来入侵的防御能力高于其他两个时期。在不同生长阶段，叶片类黄酮代谢标记物的变化表现为一个代谢途径。通过对关键代谢物与生长阶段的相关性分析，筛选出具有重要意义的差异代谢物，应用于代谢网络通路分析。图3显示了一个类黄酮通路图，使用连接矩阵报告代谢通路中代谢改变的关键点。
图3 | 不同生长期长柄扁桃叶中黄酮类化合物的代谢途径
通过代谢组学分析，可以更清楚地看到长柄扁桃叶片中黄酮类化合物的时空分布差异。叶片切片明显分为3个区域，不同类型细胞中黄酮类化合物含量有明显差异。黄酮类化合物在不同细胞和细胞室中的位置可能与它们在植物环境相互作用中的多种功能有关。由于黄酮类化合物是通过位于内质网细胞质表面的特征明确的多酶复合物合成的，高效的类黄酮转运系统将这些代谢物传递到不同的膜限制区室。因为一些糖类和类黄酮分泌的细胞外，核和细胞壁叶表皮细胞的荧光强度相对较高，所以表皮细胞核中黄酮类化合物的含量相对较高，但在细胞质中几乎没有荧光。随着叶的衰老，细胞壁类黄酮含量增加，可溶性类黄酮含量减少。这表明这些代谢物的空泡流出并沉积在细胞壁。槲皮素和山酚衍生物也在甘草花花瓣表皮细胞的细胞壁中被观察到。此外，苯丙素，特别是羟基肉桂酸衍生物，通过与复杂碳水化合物酯化而促进细胞壁的形成。
叶绿体长期以来一直被报道含有类黄酮，并能够进行类黄酮生物合成。在长柄扁桃叶片中，作者发现黄酮类化合物主要在栅栏组织和海绵组织中积累，表明这些敏感组织需要保护。由于维管束可以长距离运输黄酮类化合物，因此在硬核期(AP3)叶片中黄酮类化合物含量增加，温度和光照持续时间增加这一时期。植物将类黄酮运输到水果中，保护水果免受紫外线的伤害。在果实成熟期(AP6)，黄酮类化合物含量降低。通过显微结构分析，作者还发现长柄扁桃叶片中角质层和维管束发达，栅栏组织排列紧密，气孔数量众多。此外，以前的报告已经发现，在恶劣的环境中，一些物种的致密蜡覆盖可能有助于减少水分的流失，通过降低叶片吸收的光量和随之而来的热负荷。
●研究结论
长柄扁桃生物活性代谢产物在不同生长阶段的时间变化，特别是黄酮类化合物的类型和合成途径。采用CLSM分析长柄扁桃叶片中黄酮类化合物在不同时间的组织位置。通过荧光定量验证，长柄扁桃叶片的类黄酮含量在果实发育期含量最高。阐明了黄酮类化合物在长柄扁桃叶片不同生长发育阶段的关键作用。
文末看点
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