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荧光 PCR 异常结果原因解读

2021-07-20 23:08

2020 年 5 月 27 日公司推出了《定量 PCR 病毒检测实验成功要领》的 PCR 专题讲座,讲座中我们列举了大量实验中遇到的荧光 PCR 异常结果,分析了其产生原因,给出了解决办法。这期文章,是我们在之前的基础上再次详细整理。包括汇总了 PCR 技术服务生涯中所遇到的大量荧光 PCR 其它种类的异常结果,分析其中的问题并解析产生的原因,供大家参阅。

一、 不同线型、相同的原因——蒸发

话不多说,先来看几个实验结果曲线 :



上一组图中的几个结果都有一个明显的特点:曲线线性往上抬,这种问题一般都是微量蒸发导致的,蒸发的结果会有两种:直接变成水蒸气蒸发到反应管外(密封不严实)或者形成冷凝水挂在反应管壁上(一般与耗材选择有关)。当反应体系中并没有发生 DNA 的扩增,在不考虑其它影响的情况下,荧光强度基本维持不变;此时如果有蒸发,溶质的量不变,溶剂的量减少,则溶液浓度升高,随之表现为荧光强度的线性增加。

下面再来看一组结果:



上面一组四张图片的结果形成的原因也是蒸发,但是相比较前一组的结果却明显不同,导致他们的原因是大量蒸发。其特点是:刚开始蒸发时荧光信号逐渐增加,直到溶液被彻底蒸干,最后荧光维持恒定或者下降(整个反应环境已经变了,离子浓度也变了,里面发生了更复杂的反应)。
 

二、起伏折线—气泡破裂还是电压不稳?

在 PCR 实验中,有时会遇到线形有较大的起伏或波动,有时会形成折线,有的甚至呈现脉冲状,如下面一组图。




以上几张图片都是在实验过程中出现了气泡,导致中途产生了较大的波动,其特点是单个样本的几个通道的荧光曲线同时在某个循环出现趋势一致的波动。分析其原因是:气泡在 PCR 反应的过程中被加热,在某个时刻破裂,此时出现荧光扰动,在这个循环检测到的荧光型号和上一个循环不一样,此时如果波动位于基线期很可能就被软件识别为开始扩增的拐点,扩增曲线就会产生结果,如下图第八个循环:



区别于钨丝灯光源的仪器电压不稳导致的波动,如下图:



上图为某品牌仪器在使用过程中出现电压不稳导致钨丝灯光源不稳,进而产生了荧光波动。电压不稳导致荧光曲线波动的特点是:所有样本的所有通道在某个循环出现趋势一致的荧光波动,这是和气泡破裂导致的波动的最大区别。

三、 等温扩增、蒸发、探针降解曲线很接近?

前面我们讲了蒸发的几种线形特征,和蒸发相近的线形还有几种,一种是等温试剂的某些特别结果的线形(等温试剂有线性扩增如 LAMP,还有指数扩增如 RPA),另一种是探针降解的线形。然而目前很多等温试剂都是采用荧光标记,检测平台同样也使用了荧光 PCR 仪。



区别与 PCR 的热启动酶,等温试剂的酶有的并没有热启动功能,线性等温扩增如 LAMP 试剂,它的酶的工作温度相对较高(60℃左右)如果开始阶段的反应就在仪器上被检测到,则会出现类似 PCR 基线期;指数等温扩增如 RPA 试剂,它的酶的工作温度相对较低(39℃左右),加之没有热启动设置,在常温左右试剂就能反应,很多时候上机检测前已经出现基线期和指数期已经错过,上机的时候直接进入线性期,出现了线性扩增的情况。

如下图。



了解了上面原理我们可知有些恒温扩增的方法,其荧光曲线是和蒸发很像的,如下图。



在实验中还会遇到有些试剂有些特定通道每次实验都会往上斜,看上去也和蒸发的曲线走势很像,区别是这种现象在所有样本的同一个通道都是这样,这种现象一般是试剂探针不稳定,反应中出现非特异降解。如果在多个仪器的原始曲线都是这样(把原始数据导出到 Excel 表格,用 Excel 表格绘制图线),就更可以确定是探针降解了。如下几组图是同样的试剂在不同的仪器上的结果:




可以看到在不同仪器上都是原始曲线斜向上,原因就是探针降解了,再比如下图:




我们分析一下:没有降解的阴性样本曲线是平直的,为什么探针降解后原始曲线斜着向上呢?这里涉及到 Taqman 探针的工作原理(如下图)。



完整的 Taqman 探针由于发光基团和淬灭基团的共振效应,受到激发光激发后,发光基团并不对外显示荧光;如果在实验的过程中 DNA 扩增后探针与之结合,探针被水解切开,此时淬灭基团无法再对发光基团淬灭,当再次受到激发光照射后发光基团就会对外发射荧光。当探针发生降解的情况之后,同样的道理:淬灭基团无法对发光基团淬灭,此时就会出现荧光信号逐渐斜向上增加,随着时间的推移越降解越多,荧光慢慢升高。

四、 耗材都从哪些方面影响我们的PCR实验?

耗材对 PCR 实验的影响其实是比较重要的,除了上文说到的蒸发还会影响光热性能,分别来看几组实例:



如上图:图中两组实验用的是同样的试剂,分别使用两种透光性能不同的耗材,不仅荧光扩增高度不一致,而且透光较差的耗材在同一阈值情况下 Ct 值也滞后不少。



如上图:同样光学性能的耗材,左图为新开封的耗材,干净无污染;右图的耗材放置时间较长有灰尘,实验中对试剂有干扰。



如上图:同样的样本,不同的耗材,角度不合适的耗材,会影响加热,如果角度过小不能和模块贴合紧密相当于恒温时间变短,很可能出现 Ct 滞后。




五、 异常波动——光路问题还是软件错配问题?

当荧光曲线产生超出寻常的较大的波动时就要注意仪器的问题了。



仪器光路系统可能出现问题。



不同版本仪器的软件混用或者是仪器参数混乱,需要和工程师确认。

六、 ROX 校正和模板中的抑制剂怎样影响我们的 PCR 实验结果?

在实验过程有时会出现扩增趋势没有问题,但是线形并不光滑,有可能是错误勾选了参比荧光通道,此时纠正过来结果就会正常,这种情况扩增的图线看上去有点像实验样本中含有抑制剂的情况下的曲线。如下图:



左图:错误选择了 ROX 参比荧光;右图:参比荧光纠正后结果正常。

抑制作用在 PCR 实验中也是会遇到的,大部分抑制都可以通过稀释原始样本重新实验解决。如下图:强阳性抑制。



如上面一组图:强阳性抑制是由于样本中模板浓度太高,上去就把几乎所有探针或者染料结合,之后表现为扩增效率(原始曲线的切线斜率)较低;当对原始样本稀释后扩增效率升高而且扩增高度也变大。

还有些PCR实验的抑制剂是来自于样本中的杂质,如下图:



左图用的粗提法(一步法)纯化的核酸,右图用的标准磁珠法纯化的核酸,同样的样本和试剂,标准磁珠法纯化的样本更加纯净,原始曲线的线型也更光滑。



以上两个样本同样是高浓度的样本(H07)中有抑制剂,稀释后的样本抑制作用减弱,效率和扩增高度都变大。

七、PCR实验室最难缠的气溶胶污染

随着季节的更替、实验室一种 PCR 试剂的长期使用、在实验室附近对扩增产物进行高压灭菌以及实验环境的变化,气溶胶污染的问题就会随之而来,气溶胶污染是实验室工作中遇到的十分难处理的问题。以下三个实验结果对外表现都是较大的 Ct 值,但是产生的原因各不相同。



A 现象:可能为引物二聚体或非特异扩增等试剂体系问题。Ct 值(或者拐点)不大,没有位于低拷贝区,Ct 非最小,扩增曲线不典型,排除强阳性抑制,初期实验就出现,长期试验中经常出现,且和多数阴性、空白样本相关,多通道实验更甚(因为多通道试剂引物和探针之间的相互作用更为复杂,尤其染料法)。

B 现象:Ct 值较大,有扩增型曲线,长期试验中随机出现,这种现象一般是弱阳性样本,需要复查。

C 现象:Ct 值较大,有扩增型曲线,反应整板有部分翘尾,长期试验中,翘尾试验结果占比越来越大,这时就要提防气溶胶污染。其的预防和检测有机会再做深入的探讨,这里不再赘述。

来源:杭州博日科技股份有限公司 点击量:

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