免疫标记技术之 ELISA_企业动态

免疫标记技术是将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物来反应抗原抗体反应的情况，从而间接地测出被检抗原或抗体的存在与否或量的多少。常用的标记物有荧光素、酶、放射性核素及胶体金等。免疫标记技术具有快速、定性或定量甚至定位的特点，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。其中 ELISA 应用最为广泛。

在 ELISA 方法中，比较常见的有双抗体夹心法，竞争法，间接法，捕获法（测定 IgM）。

双抗体夹心法

对于含有多个抗原表位的大分子物质，一般采用 ELISA 双抗体夹心法测定其浓度。其具体实验步骤如下：
1. 将包被浓度为 1ug/ml-5ug/ml 的抗体滴加于 PS 微孔板，2-8℃ 过夜或 37℃ 温育 2h；
2. 甩干微孔板内的液体，加入一定浓度的无关蛋白（一般为 BSA）封闭多余位点，37℃ 温育 1h 后甩干微孔板内液体，洗涤除去游离的抗体和无关蛋白；
3. 加入待测样本（如血清，血浆，尿液，细胞裂解物等）。37℃ 温育 2h 后，样本中含有的待测物便会和固定在微孔板上的特异性抗体发生特异性结合；
4. 加入一定比例的酶标检测抗体，37℃ 温育 1h 后经洗涤即可用 TMB 底物溶液显色（亦可将检测抗体进行生物素标记，HRP 进行亲和素标记后进行底物显色，该系统的引入可以极大的提高灵敏度，极大的放大反应效果，使信号呈现更加明显）；
5. 2N 终止液终止后用酶标仪于 450nm 处读取 OD 值。

竞争法

竞争法一般用来对小分子物质（即抗原表位比较少）进行浓度测定。具体实验步骤如下：
1. 将包被浓度为 1ug/ml-5ug/ml 的抗体滴加于 PS 微孔板，2-8℃ 过夜或 37℃ 温育 2h；
2. 甩干微孔板内的液体，加入一定浓度的无关蛋白（一般为 BSA）封闭多余位点，37℃ 温育 1h 后甩干微孔板内液体，洗涤除去游离的抗体和无关蛋白；
3. 加入等体积的待测样本（如血清，血浆，尿液，细胞裂解物等）和生物素标记的该小分子物质，使其进行竞争性结合，37℃ 温育 1h 后，甩干孔内液体洗板；
4. 加入一定比例的 HRP 标记的链霉亲和素 37℃ 温育 45min, 甩干微孔板内液体洗板，TMB 底物溶液显色，颜色的深浅与待测样本中目标物的含量呈负相关；
5. 2N 终止液终止后用酶标仪于 450nm 处读取 OD 值。

间接法

ELISA 间接法一般用来对抗体效价进行测定，其具体实验步骤如下：
1. 将包被浓度为 1ug/ml-5ug/ml 的抗原滴加于 PS 微孔板，2-8℃ 过夜或 37℃ 温育 2h；
2. 甩干微孔板内的液体，加入一定浓度的无关蛋白（一般为 BSA）封闭多余位点，37℃ 温育 1h 后甩干微孔板内液体，洗涤除去游离的抗体和无关蛋白；
3. 加不同稀释度的待测血清于微孔板内，37℃ 温育 1h 后，甩干孔内液体洗板；
4. 加入相应的一定稀释比例的酶标二抗，37℃ 温育 45min 后甩干孔内液体洗板，然后用 TMB 底物溶液进行显色；
5. 2N 终止液终止后用酶标仪于 450nm 处读取 OD 值。

捕获法

主要对 IgM 类抗体进行测定，具体实验步骤如下：
1. 将包被浓度为 1ug/ml-5ug/ml 的抗 IgM u 链的抗体滴加于 PS 微孔板，2-8℃ 过夜或 37℃ 温育 2h；
2. 甩干微孔板内的液体，加入一定浓度的无关蛋白（一般为 BSA）封闭多余位点，37℃ 温育 1h 后甩干微孔板内液体，洗涤除去游离的抗体和无关蛋白；
3. 加不同稀释度的含有待测 IgM 的血清于微孔板内，37℃ 温育 1h 后，甩干孔内液体洗板；
4. 加入特异性的针对该 IgM 的抗原，37℃ 温育 1h 后洗板，此步中目标抗原和固相微孔板上的 IgM 发生特异性结合；
5. 加入生物素化的针对目标抗原的抗体，37℃ 温育 1h 后洗板；
6. 加入 HRP 标记的链酶亲和素，37℃ 温育 1h 后洗板，然后用 TMB 底物溶液进行显色；
7. 2N 终止液终止后用酶标仪于 450nm 处读取 OD 值。

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