什么鬼？实验结果又不理想， Ct 值怎么又这么大呢？是哪一步出现了问题呢？

哎哎哎，怎么没有扩增曲线呢？

在您看到荧光定量  PCR  实验结果时，是不是也发出过这样的疑问呢？总感觉哪个实验步骤出现了问题，但又觉得每一步都没问题，真不知该从何下手啊。哎，脑瓜疼，怎么办，怎么办，该怎么办呢？不怕，不怕，「对照」来了，帮您排忧解难。

荧光定量  PCR  实验中，从样本的采集到结果分析包括多个实验步骤，不同的实验步骤可以选择不同的对照进行监控（表格 1）。

对照种类		样本采集	样本保存	核酸提取	逆转录	扩增
阴性对照	无模板阴性对照					√
	无逆转录酶对照				√	√
	阴性样本对照			√	√	√
阳性对照	扩增对照					√
	内部阳性对照			√	√	√
	阳性样本对照			√	√	√
	内参基因	√	√	√	√	√

  在荧光定量 PCR 实验中，有时候无法判断某个反应孔中的扩增是来自于样本的真实扩增呢？还是来源于污染呢？这时，就需要阴性对照来监控和发现污染的发生。常见的阴性对照包括以下几种：

1、无模板对照：
无模板的阴性对照（No Template Control，简称 NTC）是指使用了水代替荧光定量 PCR 反应中的核酸，其他的试剂按比例正常加入，用于监测反应体系中的污染。正常情况下，NTC 孔中不会有扩增；当 NTC 孔出现扩增时，则预示体系中可能有污染。在 SYBR Green 实验中，EZBioscience 分子生物学实验室总结出了最容易导致 NTC 出现扩增的两种情况：一是通过观察熔解曲线，如果 NTC 与目的基因熔解曲线峰形不重叠（一般 NTC 的 Tm 值较目的基因 Tm 值小），这种情况下，NTC 的 Ct 值是由引物二聚体造成的，此时可通过优化引物的设计来减少引物二聚体对结果的影响。二是 NTC 与目的基因的熔解曲线峰形重叠（即 NTC 的 Tm 值等于目的基因的 Tm 值），此时需要计算目的基因的 Ct 值与 NTC 的 Ct 值的差值（△Ct）：如果 △Ct ≥ 3，气溶胶的污染程度很低，目的基因的 Ct 值可正常使用；如果 △Ct＜3，说明污染已经很严重了，目的基因的 Ct 值是不能使用的。此时就需要想方设法消除体系中的气溶胶污染。

2、无逆转录酶对照
无逆转录酶对照（No Reverse-Transcriptase Control，No RT）：在进行逆转录实验时，不加逆转录酶，进行逆转录步骤得到的 cDNA 进行后续的荧光定量 PCR 检测。如果检测到扩增，则样本中可能含有未去除干净的基因组 DNA。
EZBioscience®的 EZscript All-in-one Reverse Transcription Kit (with DNase)（货号：RT3），是一款基因组 DNA 去除与逆转录反应在一步进行的新一代快速逆转录试剂盒，包含有设置无逆转录酶的逆转录阴性对照反应所需的 NC Buffer，便于检测 RNA 模板中是否有基因组 DNA 的残留。

3、阴性样本对照
阴性样本对照（Negative Sample Control）是指不表达目的基因的样本，也可以是样本保存液。对阴性样本进行了提取、逆转录和荧光定量 PCR 检测。如果出现扩增，则说明其中的某一个实验过程出现了污染，结合 NTC 的结果，来判断是否样本提取过程中引入了污染。 荧光定量 PCR 实验中，当样本孔出现一个无扩增或者 Ct 值偏大的，我们不知道到底是真的没有检测的目的基因表达呢，还是实验的某个环节出现问题了呢。为了发现这种假阴性的发生，合理的阳性对照可以监控实验的不同步骤： 扩增对照（Amplification Control）：可使用含有目的基因片段的质粒、假病毒或者基因组 DNA/cDNA 作为扩增阳性对照，监控荧光定量 PCR 的反应体系是否正常。当扩增对照 Ct 值大于预期或者没有扩增，则说明定量 PCR 体系存在问题。 阳性样本对照（Positive Sample Control）：通过选择阳性的样本作为单独的样本进行提取和后续的 RT-PCR，通过 Ct 值评判实验流程。
  内部阳性对照（Internal Positive Control，IPC）是指在 RNA 提取前，向每个待检测样本中加入特定拷贝数的外源 DNA 或 RNA（不含目的片段），并在荧光定量 PCR 中进行单管多重 PCR，同时检测目的基因和这段序列，进而通过 Ct 值判断对应样品中的核酸富集和扩增效率。 内参基因（Endogenous Control）：实验过程中可通过内参基因的 Ct 值来判断取样本降解情况。

希望通过以上的介绍，大家以后做荧光定量 PCR 实验时能够得心应手，得到好的实验结果，Paper 发发发！