早在 1984 年人们就发现反义 RNA 能够抑制基因的表达,但后来人们发现发现双链 RNA 在抑制基因表达方面实际上比单链 RNA 更有效。RNA 干扰现象是 1990 年由约根森( Jorgensen )研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的影响时所发现的,为得到颜色更深的矮牵牛花而过量表达查尔酮合成酶,结果意外得到了白色和白紫杂色的矮牵牛花,并且过量表达查尔酮合成酶的矮牵牛花中查尔酮合成酶的浓度比正常矮牵牛花中的浓度低 50 倍。约根森推测外源转入的编码查尔酮合成酶的基因同时抑制了花中内源查尔酮合成酶基因的表达。
1992 年 ,罗马诺( Romano )和 Macino 也在粗造链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达。1995 年 , Guo 和 Kemphues 在线虫中也发现了 RNA 干扰现象。1998 年 ,安德鲁法厄( Andrew Z. Fire )等在秀丽隐杆线虫( C.elegans )中进行反义 RNA 抑制实验时发现，作为对照加入的双链 RNA 相比正义或反义 RNA 显示出了更强的抑制效果。从与靶 mRNA 的分子量比考虑,加入的双链 RNA 的抑制效果要强于理论上 1:1 配对时的抑制效果,因此推测在双链 RNA 引导的抑制过程中存在某种扩增效应并且有某种酶活性参与其中。并且将这种现 象命名为 RNA 干扰。
shRNA
小发卡或短发卡 RNA (a small hairpin RNA or short hairpin RNA，shRNA)是一段具有紧密发卡环(tight hairpin turn)的 RNA 序列，常被用于 RNA 干扰沉默靶基因的表达。利用载体把 shRNA 导入细胞，载体中的 U6 启动子确保 shRNA 总是表达;shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上(RNA-induced silencing complex，RISC)，该复合物能够结合到目的 mRNAs 并将其降解。shRNA 是由 RNA 聚合酶 Ⅲ 转录的，哺乳细胞中的 shRNA 产物有时会促使细胞产生干扰素反应(细胞遇到病毒侵袭时做出的自我防卫反应)，而 miRNA 却不会遇到这种问题(miRNA 是由 RNA 聚合酶 Ⅱ 转录，与转录 mRNA 的聚合酶相同)。shRNA 也被用于植物和其它系统中，在这些系统中不需要 U6 启动子的驱动。在植物中，常用的增强表达的启动子是 CaMV35S(cauliflower mosaic virus 35S),在这种情况下，RNA 聚合酶 Ⅱ 参与了转录，起始 RNA 干扰。
设计原则
1. 克隆到 shRNA 表达载体中的 shRNA 包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由 pol Ⅲ 启动子控制。随后再连上 5-6 个 T 作为 RNA 聚合酶 Ⅲ 的转录终止子。
2. 两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。
3. Stratagene 发现 29 个寡核苷酸较之原先推荐的 23 个寡核苷酸可以更有效地抑制目的基因。
4. 在启动子下游的酶切位点下方紧连一个 C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生。
5. ShRNA 目的序列的第一个碱基必须是 G 以确保 RNA 聚合酶转录。如果选择的目的序列不以 G 开头，必须在紧连正义链的上游加一个 G。
6. shRNA 插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有 shRNA 插入片段的克隆。在比较了众多不同长度和序列的茎环，5'TCAAGAG3' 序列最为有效。
7.5-6 个T必须放置在 shRNA 插入片段尾部以确保 RNA 聚合酶 III 终止转录。
8.在正义链和反义链序列上不能出现连续 3 个或以上的 T。这可能导致 shRNA 转录的提前终止。
目前获得 siRNA 主要有体外制备和体内表达两种方式：
化学合成:许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成 siRNA。主要的缺点包括价格高,定制周期长,特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高,为一个基因合成 3-4 对 siRNAs 的成本就更高了,比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。
不适用于:筛选 siRNA 等长时间的研究,主要原因是价格因素
分析流程
服务优势
1. 设计 3 个靶位点，至少有一条可以达到 70 % 的干扰效率
2. 高效重组方法，快速构建周期只需 4~7 个工作日
3. 多个载体供您选择，定制服务
4. 启动子，荧光标签，筛选标记任意选择
5. 满 3 个构建，即可赠送 1ug 总量的阴性对照质粒
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