本文摘选自：陈宏利，《The study of establishment of an in vivo tumor model by three-dimensional cells culture systems methods and evaluation of antitumor effect of biotin-conjugated pullulan acetate nanoparticles(2019.1.19).doi.org/10.1080/21691401.2018.1544142《人造细胞，纳米医学和生物技术》
文章摘要
在该研究中，三维（3D）水凝胶用于体外人肝细胞癌（HepG2）细胞培养系统和建立体内异种移植肿瘤模型。基于我们之前关于生物素共轭的支链淀粉纳米粒子（Bio-PA NPs）作为抗癌药物载体的研究，我们进一步研究了 NPs 在二维（2D）和 3D 细胞培养系统中的抗肿瘤作用。当嵌入 3D 水凝胶中时，HepG2 细胞形成肿瘤球状体，细胞质肌动蛋白微纤维素在 7 天内重新排列。体外细胞毒性结果表明，与 2D 系统相比，3D 水凝胶中的 HepG2 细胞对 Bio-PA NPs 处理更具抗性。肿瘤的体内形成率使用 3D 培养系统方法的异种移植肿瘤模型为 98.2%，显着高于使用 2D 培养细胞（76.4%）。然后我们在雌性裸鼠的右前腋中注射 3D HepG2 细胞系统，并评估 Bio-PA NPs 的体内抗肿瘤功效。总之，这些结果表明 3D 水凝胶系统中的 HepG2 细胞已显示出提供体外和体内模型以及评估 Bio-PA NPs 的潜力。
图一：使用透析方法制备 Bio-PA / EPI NP 并在体内和体外建立肿瘤模型的示意图
PS：盐酸表柔比星（ Epirubicin Hydrochloride）就是我们通常说的表阿霉素，表柔比星可以嵌入 DNA 而抑制核酸的合成，是一种广谱的抗肿瘤药物。临床上，常用它来治疗白血病，多发性骨髓瘤，乳腺癌，肺癌，胃癌，直肠癌，卵巢癌等。这个药物要按疗程给药，一般情况下，每三周一次，根据具体的癌症不同，使用剂量不同。这个药物主要是经肝脏代谢，如果肝功能不好的病人需要减少剂量。
图二：通过透析方法制备的 Bio-PA NPs（a）和 Bio-PA / EPI（b）的 TEM 图像
根据先前的研究，通过透析方法制备 Bio-PA NP。TEM 表明，无论生物-PA 的 NP 和透析方法制造 EPI-加载的 NP 是球形的形状（图中）。然而，粒子的平均直径从（130.9±10.36）nm（Bio-PA NPs）增加到（169.6±7.94）nm（载有 EPI 的 NPs），多分散指数低于 0.5，表明单色散，确定通过动态光散射。此外，zeta 电位分别为 -（28.8±2.02）mv 和 -（15.2±2.76）mv。Bio-PA NPs 中的 EPI 负载量和包封率分别为 0.73±0.038μmol/ 100 mg 和 79.8%±3.0%。
图三：来自 Bio-PA / EPI NP 的 EPI 的体外释放曲线
Bio-PA NPs 的 EPI 累积释放曲线如图所示。显然，EPI 在最初的 12 小时内都表现出快速的初始药物释放，然后在这些 NP 中观察到持续的药物释放模式，并且从 NP 释放的 EPI 的量高于与 3D 水凝胶混合的 Bio-PA NP。例如，在 12 小时内，Bio-PA NPs 的 EPI 释放量仅为 51.6%，但与 3D 水凝胶混合的 Bio-PA NPs 达到 24.1%。正如预期的那样，与 3D 水凝胶混合的 Bio-PA NPs 导致释放速率和释放量的显着降低。该结果是由于水凝胶降低药物扩散速率而引起的。
图四：不同培养模型中的 HepG2 细胞的生长曲线
从细胞生长曲线可以看出（上图），3D 培养体系中 HepG2 细胞生长曲线的滞后期长于 2D 培养基。根据已经报道的 HepG2 细胞研究的存活优势，已经显示 3D 中的更多细胞与 2D 细胞相比在细胞周期的 G1 期积累更长。
图五：不同培养模型中 HepG2 细胞的形态变化
2D 培养环境中粘附的 HepG2 细胞在平面刚性表面上呈多边形（图 a），但通过倒置显微镜成像发现 HepG2 细胞在 3D 中生长成球形并聚集形成同质多细胞球体（图 b）。
陈教授团队发现 3D 培养环境中的细胞表现出较高的球状体形成率（图 c）。HepG2 细胞在水凝胶内以 3D 方式生长，这导致形成具有许多细胞层的聚集细胞团以及培养时间的延长。已经显示聚集成球状体的细胞培养物成功地模拟了实体瘤异质性。3D 细胞培养为个体细胞提供合适的微环境，以维持其正常的 3D 形状，结构，最佳细胞生长，分化和功能，以及产生组织样构建体的能力。3D 细胞培养方法是研究体内，细胞 - 细胞相互作用和细胞 - 细胞外基质（ECM）相互作用的有力技术，并且通常用于抗癌药物筛选。
几种方法报道，细胞往往聚集成 3D 系统的球体。其中一个主要原因是细胞之间的粘合力强于细胞和表面之间的粘合力。水凝胶是 3D 组织平台的理想材料，因为它们易于控制的密度和灵活性有助于模拟 ECM，从而促使细胞与相邻细胞形成复杂的相互作用并接收和传递信号。因此，通过使用 3D 水凝胶产生 HepG2 细胞的同源多细胞球状体。
图六：单层 2D& 球体中的 3D 肿瘤组织的冷冻切片
陈教授团队进一步观察了 HepG2 细胞在 3D 细胞培养系统和 2D 细胞培养中的细胞骨架。如图所示，他们发现 3D 水凝胶中 HepG2 细胞的细胞质肌动蛋白微丝化物重排并显示出与体内肿瘤组织的结构相似性。我们认为 3D 细胞培养水凝胶可以固定细胞并减少细胞的损失，而且，它提供了与体内细胞外基质相似的微环境，诸如组织特异性效应或某些物理力的外部刺激对细胞性能，细胞形状和细胞骨架结构具有深远的影响。3D 中的 HepG2 细胞倾向于聚集成多细胞球状体。并且细胞参数包括细胞形态，细胞膜之间的物理力，肌动蛋白细胞骨架，核都与 2D 不同。更紧密的细胞排列和更多细胞聚集是促进聚集成多细胞球体的特征的实例，导致类似于体内的肿瘤组织。
图七：2D 和 3D 培养模型中对 HepG2 细胞的细胞毒性
使用 CCK8 测定评估了在 2D 塑料表面和 3D 系统上生长的 HepG2 细胞的存活率。从结果数据（图 a）可以看出，浓度范围为 0-1000 μg/ ml 的空白 Bio-PA NPs 对 2D 或 3D 细胞培养方法培养的 HepG2 细胞增殖无显着影响。在 24 和 48 小时孵育时，可以推断出空白的 Bio-PA NPs 在所用浓度范围内对细胞没有毒性。
接下来，陈教授团队进一步测量了 EPI（图 b）和载有 EPI 的 NPs（图 c）对 HepG2 细胞的细胞毒性，并评估了 2D 和 3D 系统。如图 b、c 所示，比较处理组的结果，与 2D 系统相比，在 3D 培养系统中阿霉素处理后所有细胞表现出更高的存活率。而且载有 EPI 的 NPs 处理后 HepG2 细胞更具有抗性，降低了 HepG2 细胞的药物敏感性。
文章通过两种细胞培养方法在裸鼠中建立了皮下肿瘤模型。将 2D 和 3D 中的 HeG2 细胞分别皮下注射到裸鼠中以模拟携带肝肿瘤的小鼠。3D 细胞注射肿瘤形成率为 98.2%，显着高于 2D 培养细胞（76.4%），肿瘤形成时间（肿瘤体积至 200 mm 3）明显缩短（图 a）。肿瘤形成和发育是动态过程，其中癌细胞在体内分化，增殖和迁移彼此之间以及与周围的 3D 环境相互作用。HeG2 细胞在 3D 更容易地自组装成球状体，然后球体再现形态和肿瘤组织的生物学性质。
此外，对于裸鼠的体重和每日食物摄入量，2D 和 3D 组之间也没有显着差异（图 b）。
在皮下接种后以特定时间间隔从裸鼠移除肿瘤/水凝胶的图片（图 c）， 3D 中的 HeG2 细胞形成更大的肿瘤团块。
在注射后第 21 天，处死所有动物并切除肿瘤用于组织学分析。（图 d）显示了用血红素和曙红（H＆E）染色的肿瘤组织切片的代表性组织病理学的显微镜检查。在组织学分析中， 3D 细胞培养的裸鼠皮下形成的肿瘤组织更紧密。
图八：体内行肿瘤功效
文章进一步评估了 Bio-PA / EPI NP 的体内抗肿瘤活性。给小鼠每 3 天注射 EPI 剂量为 3.0 mg / kg 的游离 EPI 和 NP，连续 5 次。注射后，每三天检测肿瘤体积变化。显然，Bio-PA / EPI NPs 即使在 3.0 mg / kg 的低 EPI 剂量下也显着抑制肿瘤生长，并且平均肿瘤重量显着低于对照组和游离 EPI 治疗组 （图 a、b）。文章认为载有 EPI 的 NPs 对肿瘤生长的有效抑制是由于它们的长循环和体内肿瘤靶向递送的 EPI。
文章结论
总之，文章报告了在 3D 中培养 HepG2 细胞的能力以及在体外和体内评估 Bio-PA / EPI NPs 与 3D 培养细胞的抗肿瘤功效。HepG2 细胞在水凝胶内以 3D 方式生长，这导致形成均质的多细胞球状体以及培养时间的延长。Bio-PA / EPI NPs 对 HepG2 细胞单层具有生长抑制作用，同时降低对 3D 中 HepG2 细胞的药物敏感性。在 3D HepG2 细胞肿瘤裸鼠中，Bio-PA / EPI NPs 可以在低 EPI 剂量下抑制肿瘤生长。3D 水凝胶培养模型具有改善细胞培养策略的潜力，可用于在裸鼠中建立皮下肿瘤模型。因此，本研究中提供的数据可用于评估靶向抗癌药物 NPs。
-END-
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文章摘要
在该研究中，三维（3D）水凝胶用于体外人肝细胞癌（HepG2）细胞培养系统和建立体内异种移植肿瘤模型。基于我们之前关于生物素共轭的支链淀粉纳米粒子（Bio-PA NPs）作为抗癌药物载体的研究，我们进一步研究了 NPs 在二维（2D）和 3D 细胞培养系统中的抗肿瘤作用。当嵌入 3D 水凝胶中时，HepG2 细胞形成肿瘤球状体，细胞质肌动蛋白微纤维素在 7 天内重新排列。体外细胞毒性结果表明，与 2D 系统相比，3D 水凝胶中的 HepG2 细胞对 Bio-PA NPs 处理更具抗性。肿瘤的体内形成率使用 3D 培养系统方法的异种移植肿瘤模型为 98.2%，显着高于使用 2D 培养细胞（76.4%）。然后我们在雌性裸鼠的右前腋中注射 3D HepG2 细胞系统，并评估 Bio-PA NPs 的体内抗肿瘤功效。总之，这些结果表明 3D 水凝胶系统中的 HepG2 细胞已显示出提供体外和体内模型以及评估 Bio-PA NPs 的潜力。
图一：使用透析方法制备 Bio-PA / EPI NP 并在体内和体外建立肿瘤模型的示意图
PS：盐酸表柔比星（ Epirubicin Hydrochloride）就是我们通常说的表阿霉素，表柔比星可以嵌入 DNA 而抑制核酸的合成，是一种广谱的抗肿瘤药物。临床上，常用它来治疗白血病，多发性骨髓瘤，乳腺癌，肺癌，胃癌，直肠癌，卵巢癌等。这个药物要按疗程给药，一般情况下，每三周一次，根据具体的癌症不同，使用剂量不同。这个药物主要是经肝脏代谢，如果肝功能不好的病人需要减少剂量。
图二：通过透析方法制备的 Bio-PA NPs（a）和 Bio-PA / EPI（b）的 TEM 图像
根据先前的研究，通过透析方法制备 Bio-PA NP。TEM 表明，无论生物-PA 的 NP 和透析方法制造 EPI-加载的 NP 是球形的形状（图中）。然而，粒子的平均直径从（130.9±10.36）nm（Bio-PA NPs）增加到（169.6±7.94）nm（载有 EPI 的 NPs），多分散指数低于 0.5，表明单色散，确定通过动态光散射。此外，zeta 电位分别为 -（28.8±2.02）mv 和 -（15.2±2.76）mv。Bio-PA NPs 中的 EPI 负载量和包封率分别为 0.73±0.038μmol/ 100 mg 和 79.8%±3.0%。
图三：来自 Bio-PA / EPI NP 的 EPI 的体外释放曲线
Bio-PA NPs 的 EPI 累积释放曲线如图所示。显然，EPI 在最初的 12 小时内都表现出快速的初始药物释放，然后在这些 NP 中观察到持续的药物释放模式，并且从 NP 释放的 EPI 的量高于与 3D 水凝胶混合的 Bio-PA NP。例如，在 12 小时内，Bio-PA NPs 的 EPI 释放量仅为 51.6%，但与 3D 水凝胶混合的 Bio-PA NPs 达到 24.1%。正如预期的那样，与 3D 水凝胶混合的 Bio-PA NPs 导致释放速率和释放量的显着降低。该结果是由于水凝胶降低药物扩散速率而引起的。
图四：不同培养模型中的 HepG2 细胞的生长曲线
从细胞生长曲线可以看出（上图），3D 培养体系中 HepG2 细胞生长曲线的滞后期长于 2D 培养基。根据已经报道的 HepG2 细胞研究的存活优势，已经显示 3D 中的更多细胞与 2D 细胞相比在细胞周期的 G1 期积累更长。
图五：不同培养模型中 HepG2 细胞的形态变化
2D 培养环境中粘附的 HepG2 细胞在平面刚性表面上呈多边形（图 a），但通过倒置显微镜成像发现 HepG2 细胞在 3D 中生长成球形并聚集形成同质多细胞球体（图 b）。
陈教授团队发现 3D 培养环境中的细胞表现出较高的球状体形成率（图 c）。HepG2 细胞在水凝胶内以 3D 方式生长，这导致形成具有许多细胞层的聚集细胞团以及培养时间的延长。已经显示聚集成球状体的细胞培养物成功地模拟了实体瘤异质性。3D 细胞培养为个体细胞提供合适的微环境，以维持其正常的 3D 形状，结构，最佳细胞生长，分化和功能，以及产生组织样构建体的能力。3D 细胞培养方法是研究体内，细胞 - 细胞相互作用和细胞 - 细胞外基质（ECM）相互作用的有力技术，并且通常用于抗癌药物筛选。
几种方法报道，细胞往往聚集成 3D 系统的球体。其中一个主要原因是细胞之间的粘合力强于细胞和表面之间的粘合力。水凝胶是 3D 组织平台的理想材料，因为它们易于控制的密度和灵活性有助于模拟 ECM，从而促使细胞与相邻细胞形成复杂的相互作用并接收和传递信号。因此，通过使用 3D 水凝胶产生 HepG2 细胞的同源多细胞球状体。
图六：单层 2D& 球体中的 3D 肿瘤组织的冷冻切片
陈教授团队进一步观察了 HepG2 细胞在 3D 细胞培养系统和 2D 细胞培养中的细胞骨架。如图所示，他们发现 3D 水凝胶中 HepG2 细胞的细胞质肌动蛋白微丝化物重排并显示出与体内肿瘤组织的结构相似性。我们认为 3D 细胞培养水凝胶可以固定细胞并减少细胞的损失，而且，它提供了与体内细胞外基质相似的微环境，诸如组织特异性效应或某些物理力的外部刺激对细胞性能，细胞形状和细胞骨架结构具有深远的影响。3D 中的 HepG2 细胞倾向于聚集成多细胞球状体。并且细胞参数包括细胞形态，细胞膜之间的物理力，肌动蛋白细胞骨架，核都与 2D 不同。更紧密的细胞排列和更多细胞聚集是促进聚集成多细胞球体的特征的实例，导致类似于体内的肿瘤组织。
图七：2D 和 3D 培养模型中对 HepG2 细胞的细胞毒性
使用 CCK8 测定评估了在 2D 塑料表面和 3D 系统上生长的 HepG2 细胞的存活率。从结果数据（图 a）可以看出，浓度范围为 0-1000 μg/ ml 的空白 Bio-PA NPs 对 2D 或 3D 细胞培养方法培养的 HepG2 细胞增殖无显着影响。在 24 和 48 小时孵育时，可以推断出空白的 Bio-PA NPs 在所用浓度范围内对细胞没有毒性。
接下来，陈教授团队进一步测量了 EPI（图 b）和载有 EPI 的 NPs（图 c）对 HepG2 细胞的细胞毒性，并评估了 2D 和 3D 系统。如图 b、c 所示，比较处理组的结果，与 2D 系统相比，在 3D 培养系统中阿霉素处理后所有细胞表现出更高的存活率。而且载有 EPI 的 NPs 处理后 HepG2 细胞更具有抗性，降低了 HepG2 细胞的药物敏感性。
文章通过两种细胞培养方法在裸鼠中建立了皮下肿瘤模型。将 2D 和 3D 中的 HeG2 细胞分别皮下注射到裸鼠中以模拟携带肝肿瘤的小鼠。3D 细胞注射肿瘤形成率为 98.2%，显着高于 2D 培养细胞（76.4%），肿瘤形成时间（肿瘤体积至 200 mm 3）明显缩短（图 a）。肿瘤形成和发育是动态过程，其中癌细胞在体内分化，增殖和迁移彼此之间以及与周围的 3D 环境相互作用。HeG2 细胞在 3D 更容易地自组装成球状体，然后球体再现形态和肿瘤组织的生物学性质。
此外，对于裸鼠的体重和每日食物摄入量，2D 和 3D 组之间也没有显着差异（图 b）。
在皮下接种后以特定时间间隔从裸鼠移除肿瘤/水凝胶的图片（图 c）， 3D 中的 HeG2 细胞形成更大的肿瘤团块。
在注射后第 21 天，处死所有动物并切除肿瘤用于组织学分析。（图 d）显示了用血红素和曙红（H＆E）染色的肿瘤组织切片的代表性组织病理学的显微镜检查。在组织学分析中， 3D 细胞培养的裸鼠皮下形成的肿瘤组织更紧密。
图八：体内行肿瘤功效
文章进一步评估了 Bio-PA / EPI NP 的体内抗肿瘤活性。给小鼠每 3 天注射 EPI 剂量为 3.0 mg / kg 的游离 EPI 和 NP，连续 5 次。注射后，每三天检测肿瘤体积变化。显然，Bio-PA / EPI NPs 即使在 3.0 mg / kg 的低 EPI 剂量下也显着抑制肿瘤生长，并且平均肿瘤重量显着低于对照组和游离 EPI 治疗组 （图 a、b）。文章认为载有 EPI 的 NPs 对肿瘤生长的有效抑制是由于它们的长循环和体内肿瘤靶向递送的 EPI。
文章结论
总之，文章报告了在 3D 中培养 HepG2 细胞的能力以及在体外和体内评估 Bio-PA / EPI NPs 与 3D 培养细胞的抗肿瘤功效。HepG2 细胞在水凝胶内以 3D 方式生长，这导致形成均质的多细胞球状体以及培养时间的延长。Bio-PA / EPI NPs 对 HepG2 细胞单层具有生长抑制作用，同时降低对 3D 中 HepG2 细胞的药物敏感性。在 3D HepG2 细胞肿瘤裸鼠中，Bio-PA / EPI NPs 可以在低 EPI 剂量下抑制肿瘤生长。3D 水凝胶培养模型具有改善细胞培养策略的潜力，可用于在裸鼠中建立皮下肿瘤模型。因此，本研究中提供的数据可用于评估靶向抗癌药物 NPs。
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博领生物产品三维微球制备仪利用静电场微注射凝胶包封技术可大量制备形态均一、韧性良好的细胞微球，重构器官微组织，助力肿瘤精准医疗研究！
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