CRISPR-Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences- crispr associated genes）系统是在大多数细菌以及古菌中发现的一种天然免疫系统，可用来对抗病毒以及其他病原体对细菌的入侵。其中 II 型 CRISPR/Cas 免疫系统依赖 Cas9 内切酶家族能够靶向和剪切外源 DNA，是目前使用最广泛的 CRISPR/Cas9 系统。
CRISPR 技术的出现，引领了基因编辑领域爆炸式的发展。如今，更多的工具进一步扩充了 CRISPR-Cas 基因技术，将其从单一的「基因剪刀」 扩展成多功能的「基因工具包」，展示了基于不断扩大的 CRISPR-Cas 系统令人兴奋的应用前景。下面我们来盘点一下 CRISPR/Cas9 技术及其衍生运用领域。
CRISPR/Cas9 基因编辑技术运用于罕见病亨廷顿舞蹈症的治疗
亨廷顿舞蹈症（Huntington's disease, HD）是一种遗传性神经退行性疾病，由编码突变的亨廷顿蛋白（mutant huntingtin, mHTT）的毒性蛋白的基因引起。mHTT 蛋白在脑细胞中形成聚集物，从而导致脑细胞死亡主要症状包括不受控制的运动、平衡问题、情绪波动和认知下降。
图片来自 Journal of Clinical Investigation, doi:10.1172/JCI92087
2017 年 6 月发表在 Journal of Clinical Investigation 期刊上，论文标题为「CRISPR/Cas9-mediated gene editing ameliorates neurotoxicity in mouse model of Huntington’s disease」的一项新的研究中，来自美国埃默里大学医学院、中国科学院和暨南大学的研究人员运用病毒载体运送的 CRISPR/Cas9 至 9 个月大的亨廷顿舞蹈症模式小鼠中并成功切除切脑内细胞中的 mHTT 基因的一部分并在数周后发现 mHTT 蛋白聚集物消除，并且模型小鼠的运动能力得到部分改善。
CRISPR 基因编辑技术的问世，其简洁高效的基因组 DNA 编辑效率，将基因编辑疗法推向了一个新高度。随着技术的不断的发展和完善，利用基因编辑技术治愈人类基因突变的各类罕见病的想法正越来越接近现实。
CRISPR/Cas9 介导体内内源靶向基因激活
2017 年 12 月，美国 Salk 生物研究所 Izpisua Belmonte 团队开发了新的 CRISPR/Cas9 系统，通过反式表观遗传重塑，体内激活内源性靶向基因。其核心在于：首先筛选到了高效的转录激活复合物组合 MS2:P65:HSF1（MPH）；然后设计出包含两个能够招募 MPH 转录激活复合物的 MS2 域以及含有 14bpRNA 的 dgRNA；最终在借助 AAV 病毒作为引导工具的条件下激活靶向基因（大多数 CRISPR-Cas9 技术都使用的标准 20 个核苷酸，而短 sgRNA 仅有 14 或 15 个核苷酸，这就能防止 Cas9 切割 DNA）。因此，此技术能够通过将核酸酶失活 Cas9（dcas9）融合到转录激活复合物，利用单链向导 RNA（sgRNA），能够以不改变 DNA 序列、不产生 DNA 双链断裂的方式，激活靶基因的表达。
图片来自 Cell. 2017 Dec 14;171(7):1495-1507.e15. doi: 10.1016/j.cell.2017.10.025. Epub 2017 Dec 7
Izpisua Belmonte 团队用这种技术来治疗糖尿病、肌肉萎缩症和急性肾病的小鼠模型。结果表明，CRISPR/Cas9 介导靶向基因激活可在体内产生可衡量的表型和疾病症状的改善，例如恢复小鼠正常肾功能、诱导小鼠肝细胞分化为胰腺样细胞产生胰岛素、增强小鼠肌肉功能等等。
这一技术的主要特点在于：1）不直接切割 DNA，不造成潜在有害突变的双链断裂；2）补强转录机制，诱导跨表观遗传重构；3）激活内源基因表达产生可观测生理表型改变等，为开发针对人类疾病的靶向表观疗法奠定了新的途径。
CRISPR 多重激活系统介导星形胶质细胞在体转化功能性神经元
2018 年 1 月 15 日，中国科学院神经科学研究所、脑科学与智能技术卓越创新中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组与上海科技大学黄鹏羽实验室合作完成题为《利用 CRISPR/dCas9 转基因小鼠在脑内进行多基因的同时激活》研究论文并发表于《自然-神经科学》。该研究建立了一种高效的基于 CRISPR/dCas9 的体内激活平台，并且在小鼠脑中实现了包括基因和长链非编码 RNA 在内的多个基因元件的同时激活。该体内激活系统的建立将会为在脑内研究复杂的基因网络以及获得性的表型提供重要的技术手段。
图片来自 Nat Neurosci. 2018 Mar;21(3):440-446. doi: 10.1038/s41593-017-0060-6. Epub 2018 Jan 15
研究人员首先将 SunTag-p65-HSF1 (SPH) 转录激活复合物融合到 dCas9 蛋白上并在人和小鼠的细胞里分别验证了 dCas9-SPH 系统相比以往的转录激活系统更为有效及特异。接着在 Cre 重组酶调控的 dCas9-SPH 转基因小鼠原代细胞里导入 sgRNA 激活基因和长链非编码 RNA 的可行性。实验人员进一步向 dCas9-SPH 转基因小鼠脑部定点注射靶向三个转录因子（ANN）Ascl1，Neurog2、Neurod1 的 AAV-sgRNA，结果显示 ANN 转录因子显著上调，星形胶质细胞可以直接被转化为功能性神经元。此外如果注射靶向多个基因以及长链非编码 RNA 的 AAV-sgRNA 阵列，可实现多个基因在神经元内的同时激活。
该研究证明了可以利用 SPH 小鼠在脑内实现复杂基因网络的调节，并为拓展筛选哺乳动物大脑获得性功能表型提供了新的技术方法。
整合全基因组 CRISPRa 方法使 lncRNAs 在药物耐药中发挥作用
2018 年 4 月 19 日 Cell 期刊上发表了美国哈佛医学院癌症遗传学家 Pier Paolo Pandolfi 实验室的研究，论文标题为「An Integrated Genome-wide CRISPRa approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance」。研究人员开发出一种新方法来鉴定和确定 lncRNA 在急性髓细胞白血病（AML）对化疗药物产生耐药性中所起的功能作用。这种新技术将来自公开可获得的药理学数据库的信息与前沿的 CRISPR 技术相结合，筛选影响治疗反应的编码基因和非编码基因。总而言之，这种全基因组筛查平台可用于鉴定和确定与许多健康情况相关的 lncRNA 的功能。
图片来自 Cell. 2018 Apr 19;173(3):649-664.e20. doi: 10.1016/j.cell.2018.03.052.
这一技术的意义在于允许研究人员一次分析成千上万个编码基因和 lncRNA，并可激活感兴趣的基因，利用阿糖胞苷处理细胞来观察起影响。因此，通过操纵编码基因或是非编码基因的表达来测试它对不同药物敏感性的影响能够鉴定出新的治疗靶标，借助 CRISPR 技术使得我们能够利用每种药物开展类似的研究，高效整合验证多个数据库。
纵观 CRISPR 技术在罕见病治疗、内源基因激活和药敏基因筛选方面的运用， CRISPR 系统拥有诸多优势：
1. CRISPR 调节基因组表达中的作用
基因表达降低（Knockdown）：适用于编码和非编码基因，与 CRISPR-KO 或 RNAi 互补；
基因过表达（Overexpression）：适用于编码和非编码基因。可实现基因在内源环境中过表达；
基因定位：dCas9 与荧光蛋白融合表达，可以对靶基因所在的染色体定位进行示踪；
高通量遗传筛选：利用 CRISPRi/CRISPRa 寻找目的细胞中的易感基因、通路调节关键基因以及组织发育或细胞分化中的重要基因等等。
2. CRISPR 调节基因组的优势
1）dCas9 介导的基因调控可逆；
2）CRISPR 抑制或者激活转录复合物需靶向结合在目的基因转录起始位点，降低了脱靶效应；
3）通过设计多条 gRNAs 可同时对多个靶基因进行调控；
CRISPRi 的作用类似于 RNAi，但又不同于 RNAi。RNAi 针对成熟的 RNA，而 CRISPRi 则是在 DNA 水平阻止转录的起始。与 RNAi 相比，CRISPRi 可靶向 lncRNA、microRNA、反向转录产物、细胞核内的转录本等，是研究非蛋白编码基因的有力工具。
3. CRISPR 调节基因组的局限性
1）PAM 序列限制了结合靶序列的数量；
2）染色体状态和修饰可能会影响 dCas9-gRNA 与基因组 DNA 的结合；
3）哺乳动物细胞中，不同基因的 CRISPRi/CRISPRa 的效率差异性较大；
4）当目的基因的靶序列与其它基因重叠，或受双向启动子调节时，CRISPRi/CRISPRa 介导的调控可能会影响周边的基因表达。
服务内容：
1）课题设计，合成引物
2）CRISPR/Cas9 质粒构建
3）sgRNA 活性检测
4）打靶载体构建
5）CRISPR/Cas9 体外转录制备 mRNA Crispr/Cas 技术途径及原理
产品目录：
√ 细胞系基因编辑
1）基因定制敲除
2）定制细胞系全基因敲除
√ sgRNA 基因功能分选文库（激酶、磷酸化酶/肿瘤凋亡/应激与蛋白降解/膜蛋白与分泌蛋白/线粒体与转运/基因过表达）及高通量筛选验证
1）sgRNA 基因功能分选文库
2）细胞模型高通量筛选
3）新药筛选、药靶筛选及精准医疗医学课题研究
参考文献：
1、Yang S1, Chang R1,2,3, Yang H1 CRISPR/Cas9-mediated gene editing ameliorates neurotoxicity in mouse model of Huntington's disease. J Clin Invest. 2017 Jun 30;127(7):2719-2724. doi: 10.1172/JCI92087. Epub 2017 Jun 19.
2、Liao HK1, Hatanaka F1, Araoka T. In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation. Cell. 2017 Dec 14;171(7):1495-1507.e15. doi: 10.1016/j.cell.2017.10.025. Epub 2017 Dec 7.
3、Zhou H1, Liu J2,3,4, Zhou C. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nat Neurosci. 2018 Mar;21(3):440-446. doi: 10.1038/s41593-017-0060-6. Epub 2018 Jan 15.
4、Bester AC1, Lee JD1, Chavez A2. An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance. Cell. 2018 Apr 19;173(3):649-664.e20. doi: 10.1016/j.cell.2018.03.052.
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