实验材料：台盼蓝染色剂，细胞计数板，1.5 ml 灭菌离心管，50 ml 灭菌离心管，灭菌移液管，单通道电动移液枪，灭菌枪头，CCK-8 试剂，DMEM 完全培养基，PBS，96 孔板，灭菌 150 ml 烧杯，灭菌 1.1% CaCl2 溶液，灭菌铁线圈，灭菌针头，海藻酸钠粉末，10 ml 注射器等
IC50：药物抑制细胞活力 50% 时的浓度
实验步骤：
一、配置海藻酸钠
IC50：药物抑制细胞活力 50% 时的浓度
实验步骤：
一、配置海藻酸钠
1.1 称取海藻酸钠粉末 1 g，加入装有 100 ml 纯净水的烧杯中。
1.2 烧杯中放入磁石，磁力搅拌器搅拌 6 h 以上。
1.3 用注射器吸取搅拌好后的海藻酸钠，依次用 0.8 μm、0.45 μm 的滤膜过滤，最后在无菌环境下用 0.22 μm 滤膜（无菌）过滤。
二、收集细胞
2.1 从培养箱中取出培养皿镜检，确保细胞处于健康的对数生长期状态。
2.2 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 2 次（1 ml/次）。
2.3 加 1 ml 胰酶细胞消化液（0.25% 胰酶，含酚红）于培养皿中，置于 37 ℃ 培养箱中消化 1-2 min，镜检消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，拿回安全柜后加 2 ml 培养基终止消化。
2.4 用移液枪轻轻吹打、洗脱后吸出于 50 ml 离心管中，离心机 1000 rpm×5 min，弃去上清液，保留瓶底部的细胞。加入适量 DMEM 培养基，用 1 ml 移液枪吹打分散细胞。
三、细胞计数
3.1 取 10 μL（2.4）中制备好的细胞悬浮液至 1.5 ml 离心管中，再加入 80 μl PBS , 台盼蓝（0.4%）10 μl，室温染色 5 min（此情况为稀释 10 倍，可根据实际情况进行稀释）。
3.2 将上述染色后的细胞悬浮液混合均匀后，取 10 μl 注入细胞计数板，在显微镜下累计左上、左下、右上、右下四个区域（每个区域有 16 个大格子）中的细胞总数和死细胞数（死细胞被染成蓝色）。
3.3 通过以下公式计算 2.4 所获得的细胞悬浮液中的细胞存活率和细胞密度：
细胞存活率=（总细胞数-死细胞数）/总细胞数，（当存活率>95% 才可进行后续实验）
细胞密度=（总细胞数-死细胞数）/4 ×104 × 10 个细胞/ml，（其中 10 为细胞悬浮液稀释倍数）
四、计算细胞接种液量
4.1 计算所需的细胞悬浮液（2.4 制备所得）。A549 细胞的球铺板接种浓度为 5×103 个/孔，共需 96 个孔内，因此共需要制备含 5×105 个细胞的接种液。所需细胞悬浮液的体积计算公式如下：V= 5 X 105/细胞密度。
4.2 取 V ml 的液体加入离心管，离心机 1000 rpm×5 min，弃去上清液，保留瓶底部的细胞，加入 1 ml 海藻酸钠，用移液枪混合均匀（移液枪吹打时尽量避免产生气泡）。
注意：可以制备同时使用多块 96 孔板所需的细胞，并加入相应量的海藻酸钠混匀，滴球时可以同时滴多块 96 孔板所需的三维细胞。
五、细胞滴球及种板
5.1 用注射器吸取（4.2）中的混合液，吸的时候尽量避免产生气泡（可以静置一段时间方便排除空气）。
5.2 注射器换用灭好菌的铁针头，放在电场式微粒制备仪上固定好。
5.3 在含铁圈的 150 ml 烧杯内倒满 1.1% CaCl2 溶液，放在三维微球制备仪上，针头与液面距离 1~2 cm。
PS：博领生物自主研发的三维微球制备仪器可包封出形态均一、尺寸可控的三维细胞微球、纳米材料微球等，耗时短、操作方便，助力科研创新。
5.4 打开设备电源，红线（正极）接针头，黑线（负极）接铁圈。
5.5 打开高压开关，启动设备，观察滴球情况。正常情况下混合液成线性滴出，在溶液中可以观察到颗粒沉淀。
5.6 滴完球后关闭高压开关，关闭设备电源。烧杯静置一段时间待颗粒沉淀在底部后去除大部分上清液，用移液枪转移至离心管中（至少用 1ml 移液枪）。
5.7 离心管静置一段时间后去除上清，加入不含血清的培养基润洗二次，最后加入含血清的培养基（培养基含量为 96 孔×100 ul=9.6 ml，加上损耗，一块板配制 10 ml，若是多块板则相应翻倍）。
5.8 由于三维球容易沉淀种板前可以先分装。10 ml 可以先分成两个 5 ml 的离心管然后再分成 4 个 2.5 ml 的离心管，用移液枪调节取液量为 100 μl 依次加入 96 孔板中。
注意：至少用 1 ml 移液枪，分装和取样前都需要混合均匀，枪头要紧贴侧壁推入接种液。
5.9 将种好三维细胞的 96 孔板放置于 CO2 培养箱（37 ℃、5% CO2）中培养过夜。
六、在 3D 细胞制备后保存 5 天、10 天、14 天、21 天、30 天时分别重复以下实验。
七、收集细胞的相关数据
7.1 包被的活细胞数量
7.2 三维微球的个数
7.3 三维微球的直径
八、化疗药物的处理
8.1 假设化疗药物储存浓度为 100 mM，需要设计 5 个浓度梯度进行 3 倍稀释（100.000 uM 、33.333 uM、11.111 uM、 3.704 uM、1.235 uM、 0.412 uM、 0.137 uM、 0.046 uM、0.015 uM）。从 0.046 uM 开始，每个浓度要设 3-5 个复孔。考虑到把 100 mM 的药稀释到 0.046 uM 时，取原液的量太少，误差会加大，所以需先把 100 mM 的药用 DMSO/ M-s1 细胞活性检测培养基稀释成 100 uM。
药物浓度的选择是不是根据 IC50 来选？
8.2 取出 96 孔培养板，去除上清，用 M-s1 试剂稀释药物至需求浓度，按 120 ul/孔直接加入至包被好的 96 孔板中，混匀，放置于 CO2 培养箱（37 ℃、5% CO2）至所需时间。按如下图所示进行加入
8.3 设置对照组：
（1）具有完全培养基但没有细胞、有 CCK-8 溶液的孔；
（2）具有完全培养基但没有细胞、有 CCK-8 溶液、有药物溶液的孔。
注意：96 孔板边缘上的孔培养过程中容易导致液体的蒸发，一般弃用，直接加入 PBS、水或者培养基；尽量将 96 孔板放置于接近水源的位置，以减弱蒸发作用。
九、细胞毒性检测
9.1 将 CCK-8 按 10 ul/孔加入至 96 孔板中，置于 CO2 培养箱（37 ℃、5% CO2）中孵育 2-4 小时；取出 96 孔板，于酶标仪 490 nm 波长下检测。
9.2 记录数据：
A1=OD（具有完全培养基、细胞、CCK-8 溶液、药物溶液）
A2=OD（具有完全培养基但没有细胞、CCK-8 溶液）
A3=OD（具有完全培养基、细胞、CCK-8 溶液）
生长存活率=[（A1-A2）/（A3-A2）]*100%
生长抑制率=[（A3-A1）/（A3-A2）]*100%
9.3 制作毒性曲线
以分组为横坐标，生长抑制率为纵坐标，绘制细胞生长抑制率曲线图。
2.2 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 2 次（1 ml/次）。
2.3 加 1 ml 胰酶细胞消化液（0.25% 胰酶，含酚红）于培养皿中，置于 37 ℃ 培养箱中消化 1-2 min，镜检消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，拿回安全柜后加 2 ml 培养基终止消化。
2.4 用移液枪轻轻吹打、洗脱后吸出于 50 ml 离心管中，离心机 1000 rpm×5 min，弃去上清液，保留瓶底部的细胞。加入适量 DMEM 培养基，用 1 ml 移液枪吹打分散细胞。
三、细胞计数
3.1 取 10 μL（2.4）中制备好的细胞悬浮液至 1.5 ml 离心管中，再加入 80 μl PBS , 台盼蓝（0.4%）10 μl，室温染色 5 min（此情况为稀释 10 倍，可根据实际情况进行稀释）。
3.2 将上述染色后的细胞悬浮液混合均匀后，取 10 μl 注入细胞计数板，在显微镜下累计左上、左下、右上、右下四个区域（每个区域有 16 个大格子）中的细胞总数和死细胞数（死细胞被染成蓝色）。
3.3 通过以下公式计算 2.4 所获得的细胞悬浮液中的细胞存活率和细胞密度：
细胞存活率=（总细胞数-死细胞数）/总细胞数，（当存活率>95% 才可进行后续实验）
细胞密度=（总细胞数-死细胞数）/4 ×104 × 10 个细胞/ml，（其中 10 为细胞悬浮液稀释倍数）
四、计算细胞接种液量
4.1 计算所需的细胞悬浮液（2.4 制备所得）。A549 细胞的球铺板接种浓度为 5×103 个/孔，共需 96 个孔内，因此共需要制备含 5×105 个细胞的接种液。所需细胞悬浮液的体积计算公式如下：V= 5 X 105/细胞密度。
4.2 取 V ml 的液体加入离心管，离心机 1000 rpm×5 min，弃去上清液，保留瓶底部的细胞，加入 1 ml 海藻酸钠，用移液枪混合均匀（移液枪吹打时尽量避免产生气泡）。
注意：可以制备同时使用多块 96 孔板所需的细胞，并加入相应量的海藻酸钠混匀，滴球时可以同时滴多块 96 孔板所需的三维细胞。
五、细胞滴球及种板
5.1 用注射器吸取（4.2）中的混合液，吸的时候尽量避免产生气泡（可以静置一段时间方便排除空气）。
5.2 注射器换用灭好菌的铁针头，放在电场式微粒制备仪上固定好。
5.3 在含铁圈的 150 ml 烧杯内倒满 1.1% CaCl2 溶液，放在三维微球制备仪上，针头与液面距离 1~2 cm。
PS：博领生物自主研发的三维微球制备仪器可包封出形态均一、尺寸可控的三维细胞微球、纳米材料微球等，耗时短、操作方便，助力科研创新。
5.4 打开设备电源，红线（正极）接针头，黑线（负极）接铁圈。
5.5 打开高压开关，启动设备，观察滴球情况。正常情况下混合液成线性滴出，在溶液中可以观察到颗粒沉淀。
5.6 滴完球后关闭高压开关，关闭设备电源。烧杯静置一段时间待颗粒沉淀在底部后去除大部分上清液，用移液枪转移至离心管中（至少用 1ml 移液枪）。
5.7 离心管静置一段时间后去除上清，加入不含血清的培养基润洗二次，最后加入含血清的培养基（培养基含量为 96 孔×100 ul=9.6 ml，加上损耗，一块板配制 10 ml，若是多块板则相应翻倍）。
5.8 由于三维球容易沉淀种板前可以先分装。10 ml 可以先分成两个 5 ml 的离心管然后再分成 4 个 2.5 ml 的离心管，用移液枪调节取液量为 100 μl 依次加入 96 孔板中。
注意：至少用 1 ml 移液枪，分装和取样前都需要混合均匀，枪头要紧贴侧壁推入接种液。
5.9 将种好三维细胞的 96 孔板放置于 CO2 培养箱（37 ℃、5% CO2）中培养过夜。
六、在 3D 细胞制备后保存 5 天、10 天、14 天、21 天、30 天时分别重复以下实验。
七、收集细胞的相关数据
7.1 包被的活细胞数量
7.2 三维微球的个数
7.3 三维微球的直径
八、化疗药物的处理
8.1 假设化疗药物储存浓度为 100 mM，需要设计 5 个浓度梯度进行 3 倍稀释（100.000 uM 、33.333 uM、11.111 uM、 3.704 uM、1.235 uM、 0.412 uM、 0.137 uM、 0.046 uM、0.015 uM）。从 0.046 uM 开始，每个浓度要设 3-5 个复孔。考虑到把 100 mM 的药稀释到 0.046 uM 时，取原液的量太少，误差会加大，所以需先把 100 mM 的药用 DMSO/ M-s1 细胞活性检测培养基稀释成 100 uM。
药物浓度的选择是不是根据 IC50 来选？
8.2 取出 96 孔培养板，去除上清，用 M-s1 试剂稀释药物至需求浓度，按 120 ul/孔直接加入至包被好的 96 孔板中，混匀，放置于 CO2 培养箱（37 ℃、5% CO2）至所需时间。按如下图所示进行加入
8.3 设置对照组：
（1）具有完全培养基但没有细胞、有 CCK-8 溶液的孔；
（2）具有完全培养基但没有细胞、有 CCK-8 溶液、有药物溶液的孔。
注意：96 孔板边缘上的孔培养过程中容易导致液体的蒸发，一般弃用，直接加入 PBS、水或者培养基；尽量将 96 孔板放置于接近水源的位置，以减弱蒸发作用。
九、细胞毒性检测
9.1 将 CCK-8 按 10 ul/孔加入至 96 孔板中，置于 CO2 培养箱（37 ℃、5% CO2）中孵育 2-4 小时；取出 96 孔板，于酶标仪 490 nm 波长下检测。
9.2 记录数据：
A1=OD（具有完全培养基、细胞、CCK-8 溶液、药物溶液）
A2=OD（具有完全培养基但没有细胞、CCK-8 溶液）
A3=OD（具有完全培养基、细胞、CCK-8 溶液）
生长存活率=[（A1-A2）/（A3-A2）]*100%
生长抑制率=[（A3-A1）/（A3-A2）]*100%
9.3 制作毒性曲线
以分组为横坐标，生长抑制率为纵坐标，绘制细胞生长抑制率曲线图。
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