Biorbyt科研小助手今天来给大家讲讲酶联免疫吸附测定／ELISA实验，内附有实验操作视频，不可错过！

 

ELISA原理介绍

       酶联免疫吸附测定简称ELISA，指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯**如96孔板等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。

 

        ELISA一般用于从复杂的混合物中测定特异分析物，还可用于确定分子间相互作用，如蛋白质与蛋白质及蛋白质与核酸间的相互作用等。

 

ELISA实验相比其他免疫测定方法的优势：

1. 实验中使用微量滴定板可以同时检测多种实验条件，并且可以快速地筛选出最优的实验条件。

2.可以重复测定，从而轻松地获取定量数据。

3. 由于微量滴定板的孔容量很小，相应的试剂需求量也较少。

4. 在ELISA测定过程中能够保持蛋白质的天然构象和最佳反应条件，让检测条件更接近于生理状态。

 

ELISA方法类型

         常用的ELISA方法类型有4种，分别为直接法、间接法、夹心法和竞争法，Biorbyt科研小助手给大家整理的不同种类elisa的主要区别。

 

 

下面以ELISA间接法为例演示一下实验操作。

点击以下视频，了解
ELISA间接法操作
 

        实验前准备好所需的实验试剂，主要包括96孔高吸附酶标板，抗原，包被液，封闭液，待测抗体，酶标二抗，抗体稀释液，洗涤液，显色液TMB，终止液。

1. 首先确认抗原名称／浓度，用包被液稀释抗原，将稀释好的抗原加入96孔板，加在酶标板底部，不得粘在孔壁上。然后盖上封板膜，于4℃过夜或37℃2小时。

2.  倒去未吸附的抗原稀释液，加入2%BSA进行封闭，4℃过夜或37℃2h。

3. 按实验设计要求对待测抗体进行稀释，加入包被有抗原且封闭好的酶标板，37度孵育1～2小时。注意使用排枪时不可戳到酶标板底部，每次排枪吸液体时液面相平。

4. 洗板后，加入酶标二抗，37度孵育1～2小时。

5. 洗板，若孵育时间较长可增加洗板次数。

6. 加入TMB于37度进行显色5～20分钟，观察颜色变化。

7.  加入草酸终止显色，将96孔板置于酶标仪读取波长为450nm的吸光值。

 

 

ELISA常见问题解析

Elisa常见的问题主要概括为以下3种：

1. 如何正确设置对照？

阴性对照：不含目标蛋白的就是最佳的阴性对照，一般可以选用封闭缓冲液。这种做法也让您了解到封闭缓冲液的效果如何，此外还可以知道，未加入特异性靶标时的背景信号是怎样的。

阳性对照：可选择纯化后的目标蛋白，您可能要对阳性对照蛋白进行一系列稀释，用于制作标准曲线，以及验证所用测定法的预期效果。

 

2. 如何降低高背景？

根据我们的经验，最有效的还是优化抗体稀释度。一个ELISA实验使用到的抗体较多，使用太多报告分子容易增加测定的背景，优化各个抗体稀释度达到最匹配有利于我们获得最漂亮的结果。

其次是增加洗涤次数，增加洗涤缓冲液的浓度，更换不同配方的封闭液都可以有效降低背景。

 

3. 加入酶底物后没有显色怎么办？

有很多不同的原因都能导致得不到任何信号，如果是阳性对照没有显色，先排查实验操作是否正确，试剂是否过期。

其次排查抗体抗体问题，所用的一个或多个抗体可能没有达到预期效果，也可能是目标蛋白中没有针对这个抗体的表位。比如夹心法里抗体作为检测抗体时功效不错，但作为捕获抗体时就不大好用。所以经常能做的就是收集一些不同的抗体，在不同的情况和组合中进行测试，以确定哪一个抗体能给出最佳信噪比。

 

         大家可以根据实验目的可以设置合适ELISA实验类型，当然最省事的还是直接购买biorbyt的ELISA试剂盒，因为试剂盒包含了精确的实验方案和大多数必备的试剂，非常方便高效。
 

         Biorbyt可提供各个研究领域各个靶标的elisa试剂盒，总有一款符合您的实验需求。
          如果大家还有什么想看想了解的实验操作视频，可以给我们留言。

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