我们先来看网络上的一个求助帖：
 

已经积攒了一批抗凝血，由于当时未多加考虑, 取标本后就直接放在 -80 度了，请问: 这样对提取 RNA 影响大吗？我该怎样防止血液融化时 RNA 被酶解呢？具体该怎样操作呢？ 谢谢。我是新手，请多帮助 !!!! 回复  冻存的时间过长，即使温度很低，RNA 也可能降解。 你的这种情况，在融解之前在冻块上面加入 RNA 酶抑制剂溶液后再融解，融解过程中注意抑制剂溶液及时与融化血液混合，不要剧烈振荡。只要 RNA 在冻存过程没有降解，这样就不会有太大问题。 回复  这样不可避免 RNA 的降解。 我们也遇到这样的问题，我们的首席教授告诉我们应该在冻存时直接加入 TRIZOL。这样可以避免 RNA 被降解。 回复  非常感谢！只有提提试一下了。 RNA 酶抑制剂溶液是指的什么？1 ml 血液加多少有要求吗？

从上面的求助帖中我们可以总结出几大信息：

1. 血液直接冻存到 -80℃ 再提取是个大问题，没有人能确切回复可行的操作方案。实际上即使我们查找著名的核酸纯化试剂盒公司 QIAGEN 的网站，也找不到从 -80℃ 冻存的血液中提取 RNA 的方法。
2. 血液不加任何试剂直接冻存在 -80℃ 时，RNA 会降解吗？如果会降解，多久会降解完？
3. 回复的建议都是猜测性的，没有做过实际的测试。

众所周知，RNA 容易降解，所以一般提取 RNA 都会使用新鲜的样本，如果新鲜样本不能立即提取 RNA，应立即放到 -80℃ 冻存—从这一点上讲，发帖的求助者也没做错。但关键是血液中的红细胞不含有 RNA，提供 RNA 的主要是白细胞，市面上主要的血液 RNA 提取试剂盒（比如 QIAGEN）用到的原理是将白细胞与其它组分分离（用红细胞裂解液去除红细胞）再提取其中的 RNA。一旦血液经过冷冻就会出现溶血现象，这时所有的细胞都发生破裂，已经无法分离白细胞了，使用这种方法自然也就提不到 RNA。

Simgen 的全血总 RNA 试剂盒，是无需红细胞裂解液分离白细胞，直接从全血中提取 RNA 的，是不是能从冷冻的抗凝血中提取到 RNA 呢？让我们实测一下吧：

实验材料：

-80℃ 冷冻 75 天的抗凝全血；预先按 500 µl 血样比 1 ml Buffer L9 的比例加入 Buffer L9 的同一个抗凝全血样本作为对照组（备注：Simgen 全血总 RNA 试剂盒中的 Buffer L9 与抗凝全血预混后可在-20℃ 长期冻存，RNA 不会降解）。

实验试剂：

全血总 RNA 试剂盒（simgen，Cat.No.5201050）、
cDNA 第一链合成试剂盒（simgen，Cat.No.7306025）、
2×SYBR Green PCR Mix（simgen，Cat.No.7106100）、
人 β-actin 引物（Forward TGACGTGGACATCCGCAAAG
/Reverse：  CTGGAAGGTGGACAGCGAGG）

实验方法：

1. 分两组进行对比实验，每组各做两管：第一组取 2 个 2 ml 离心管，各加入 500 µl 新鲜全血，编号 1、2；第二组加入 500 µl 新鲜全血后再加入 1 ml Buffer L9，混合均匀，编号 3、4。将两组样本置于 -80℃ 冻存，冻存 75 天。
2. 75 天后取出后置于室温，待血样全部融化后，向 1、2 中加入 1 ml Buffer L9 混合均匀；
3. 13000 rpm 离心 10 分钟；
4. 吸取 700 µl 离心上清转移到装有 500 μl 无水乙醇的 1.5 ml 离心管中，混匀；
5. 分两次将混合液转移到核酸纯化柱中，离心去滤液；
6. 依次用 500 µl Buffer WA 和 700 µl Buffer WBR 各洗涤一次；
7. 用 50 µl RNase-Free Water 洗脱 RNA；
8. 在微量紫外分光光度计上测量 RNA 的浓度；
9. 琼脂糖凝胶电泳；
10.逆转录制备 cDNA；
11.取 5 μl cDNA 模板进行 RT-PCR 检测。

实验结果：

1、在微量紫外分光光度计上用 RNase-Free Water 调零，测量洗脱下来的 RNA，结果如下，
从表一的数据上可以看出两种方法处理的抗凝血经过 75 天的长期保存后均提取出了 RNA，且浓度并无太大差异。

2、在 1% 的琼脂糖凝胶上，加入 8 μl 血液 RNA，电泳 15 min，结果如下，
 
3、荧光定量 PCRβ-actin 基因检测结果，


图二：RT-PCR 曲线（Delta Rn vs Cycle）
阳性：血液总 RNA（50 ng/μl）         1、2：500 μl 冷冻抗凝全血中提取的 RNA
阴性：无菌超纯水                   3、4：500 μl 抗凝全血加 1 ml Buffer L9 预混对按照

从图二可以看出，两组不同处理的冷冻全血中提取的 RNA 经逆转录后获取的 cDNA 在 RT-PCR 检测中几乎与阳性同时起线，且 Ct 值较靠前。

从本次实验可以得出结论：由于 Simgen 全血总 RNA 试剂盒可以从血液中直接分离纯化总 RNA，不需事先分离白细胞，自然也不怕冷冻血液溶血。本次实验测试，一次可以从 500 μl -80℃ 贮存 75 天的冷冻全血中提取到 3 μg 左右的血液总 RNA，且纯度很高，完全满足后续基因检测的需要。

最后我们可以对网络上的求助帖做几条有价值的回复了：
 

1. 在 -80℃ 冻存的抗凝全血，如果用 Simgen 全血总 RNA 纯化试剂盒提取 RNA 则结果影响不大。 2. 抗凝全血在 -80℃ 冻存时间小于 75 天的，提取到的 RNA 尚未观察到有严重的降解。 3. 解冻后的抗凝全血立即用 Simgen 全血总 RNA 纯化试剂盒提取 RNA，即使不加 RNA 酶抑制剂，RNA 也不会被降解。 4. 对具体操作感兴趣的同学，也可以点击观看视频：https://v.qq.com/x/page/g0323yn2iz8.html。