细胞培养技术创建于二十世纪初，历经一个多世纪的发展，现在已成为生命科学领域越来越重要的实验技术之一。由于细胞的特殊性，在细胞培养过程中，或在细胞建株和建系过程中，随着传代次数的增加，细胞的各种生物特性都会逐渐发生变化。因此，原始细胞种子的及时保存就显得尤为必要。在杂交瘤单抗的制备过程中，杂交瘤细胞以及克隆化得到的亚克隆细胞的冻存，是必不可少的操作。因为在没有建立一个稳定的细胞系或稳定分泌抗体的细胞系的时候，在细胞的培养过程中随时可能因细胞的污染、分泌抗体能力的丧失或遗传变异等等缘故而导致实验失败，如果没有原始细胞的冻存，则将因为上述的意外而前功尽弃。除此之外，购买、交换和运送某些细胞也需要利用细胞冻存的形式来进行。因此，及时方便地进行细胞的冻存在实际工作中显得十分必要。

 

细胞冻存要取得好的效果，多采用血清、甘油或二甲基亚砜（DMSO）等作为保护剂，最大限度的保存细胞活力。这些物质有些能提高细胞膜对水的通透性，在缓慢冷冻过程中可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。同时，有些保护剂在细胞外也能减轻溶液中高浓度溶质对细胞的损伤，进一步避免细胞在冷冻和复苏过程中受到损伤。渗透性保护剂DMSO和非渗透性保护剂血清（主要含白蛋白）是使用最为广泛，效果最为稳定可靠的。

 

此外，采用“慢冻快融”的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1到-2℃/分钟，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。复苏细胞采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

 

现有冻存方法存在的问题：
1、DMSO对细胞存在一定的毒性，用量受到限制，降低或者不使用DMSO，寻找其它替代物是最好的选择。但是目前，该技术领域还未发现冻存保护效果能与DMSO媲美的物质，因此，联合其它成分，形成新的配方，降低DMSO的含量就成了较为现实的选择。
2、血清，即使是纯化得到的白蛋白，由于其动物来源的特性，会极大增加带来病毒等感染物质的可能。而且，血清来源受限，价格昂贵，所以其使用也必然会受到越来越多的限制。因此，寻找替代血清的非渗透性保护剂也显得尤为必要。
3、目前，最成熟和最稳定的冻存细胞技术是将加有保护剂的细胞悬液置于-196℃液氮中，这样可以使细胞暂时脱离生长状态而保持细胞的特性，在需要的时候经过复苏程序，使得细胞重新生长增殖以用于实验。细胞储存在-196℃液氮中，理论上储存时间是无限的，但是液氮冻存步骤繁琐，需要经过程序降温，如先将冷冻管置于4℃冰箱10分钟，然后移至-20℃冰箱30分钟，再移至-80℃冰箱保存16-18个小时（或隔夜），最后才移至液氮罐中进行长期的储存。（其中需要注意的是-20℃条件下不可超过1个小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量的死亡。）

 

赛尔瑞成科学家团队在细胞冻存领域进行了大量研究工作，早在 2015年即自主研发了“无血清细胞冻存液”（货号：CF0101） 。产品获得了广大科研工作者的喜爱。

 

赛尔瑞成最新发明了一种新的冻存液体系： 无血清低DMSO细胞冻存液（货号：CF0201；专利申请号：202010307890.6） ，不仅可以省却对血清的使用，而且还显著降低了DMSO的用量。同时，本专利细胞冻存液冻存的细胞悬液可以直接放置于-80℃冰箱，既不需要繁琐的程序降温或采用程序降温仪，更不需要放置在-196℃液氮中，节省了大量时间和精力。该细胞冻存液通用于人和各种动物细胞株。特别配方（主要成分为5% DMSO和氨基酸）具有有效提高细胞冻存活率和复苏活力。不含血清及动物来源性蛋白，能减少各类病毒、霉菌和支原体等的污染，确保冻存细胞安全。既适用于一般培养细胞的冻存，也适用于无血清培养细胞和蛋白表达细胞的冻存。

 

产品特点：
1. 高安全性，不含血清及动物源成分，病毒、霉菌和支原体等污染可能性低，各批产品之间有更高的产品质量一致性。
2. 低DMSO，DMSO的含量为5%（v/v），极大降低了对细胞潜在的毒性作用。
3. 细胞存活率高，无批次差异。
4. 完全冻存液配方，可直接使用，方便简捷。
5. 可直接存放于-80℃冰箱冻存，无需经过费时的程序降温过程（省时、省力、省钱），不需要采用程序降温仪，更不需要放置在-196℃液氮。
6. 可原位冻存，比如杂交瘤细胞的亚克隆，可以大规模减少工作量，避免污染。

 

冻存效果对比：

 

图1. 小鼠成纤维细胞3T3细胞复苏后细胞状态对比图

对照B：存活率89%                                      本产品：存活率97%

 

图2. 人胚肾细胞293E细胞复苏后细胞状态对比图

对照B：存活率86%                                   本产品：存活率93%

 

                 注：对照A: DMEM培养基+10%血清+10%DMSO，液氮冻存；
                        对照B: Cellregen无血清细胞冻存液（DMSO 10% v/v）；
                        本  品：无血清低DMSO细胞冻存液（DMSO 5% v/v）。

 

附： 通用细胞冻存液，Cellregen无血清细胞冻存液、无血清低DMSO细胞冻存液的比较

 

	通用细胞冻存液	Cellregen 无血清细胞冻存液	无血清低 DMSO 细胞冻存液
主要成份	含血清、含 DMSO	不含血清，含 DMSO 10%	不含血清，低 DMSO 5%
细胞毒性	高	高	低
安全性	低 动物来源病毒、霉菌和支原体等污染的风险偏高	高 无动物来源病毒、霉菌和支原体等污染的风险	高 无动物来源病毒、霉菌和支原体等污染的风险
冻存细胞种类	适合含血清细胞冻存	通用型 适合各类细胞冻存	通用型 适合各类细胞冻存
无血清培养细胞生长状态	易改变易由悬浮状态回复贴壁状态	保持悬浮培养状态	保持悬浮培养状态
批次差异	批次差异大	无批次差异	无批次差异
操作方法	步骤繁琐 需程序降温冻存	简单快捷 一步冻存 -80 ℃冰箱	简单快捷 一步冻存 -80 ℃冰箱
保存设备	要求高（液氮）	要求低（ -80℃ 冰箱）	要求低（ -80℃ 冰箱）
微量冻存	细胞易死亡，存活率偏低	细胞存活率高	细胞存活率高
原位冻存	不可行	可行，且方便快捷 如 : 杂交瘤细胞孔板冻存	可行，且方便快捷 如 : 杂交瘤细胞孔板冻存