荧光定量案例解析
实时荧光定量 PCR (Quantitative Real-time PCR) 是一种在 DNA 扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应 (PCR) 循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定 DNA 序列进行定量分析的方法。
Real-timePCR 是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时检测。由于在 PCR 扩增的指数时期，模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
荧光定量技术几乎是所有生物学研究者的必备技能，很多实验室也都有相关的荧光定量的仪器设备，但并不是说有了仪器，有了试剂盒，这个实验就都能做的好，在整个实验环节中有许多需要注意的细节，有些细节还特别关键，所谓「差之毫厘，谬之千里」，上海卓立生物科技有限公司荧光定量 PCR 开展相关服务近 10 年，积攒了不少案例，荧光定量效果不好主要是有以下几个方面：
1、引物特异性
特异性引物是荧光定量的关键之一。上海卓立生物有经过实际样本检验的 25000 多对引物，可满足大多数荧光定量检测要求。对于常规模式生物，荧光定量 PCR 引物设计问题不大，现在也有很多的引物设计软件可以设计。这个实验步骤容易出问题主要有两点：
a、一定要根据所要检测的物种，找到准确的基因序列，然后再设计引物。对于移植瘤或者嵌合的组织，需要明确要检测的靶标。比如人肿瘤细胞接种到裸鼠身上，若要检测肿瘤相关基因检测，那一定是要对应人的基因组，若要检测血管生成方面的，那需要对应小鼠的基因组。对于嵌合的组织最好根据两个物种信息设计两套引物，做预实验时看下引物的特异性，以便于正式实验明确所用那对引物。
b、片段长度选择。对于荧光定量 PCR 一般会选择 80-200bp 这个区段，尽量不要超过 250bp，扩增片段太短特异性不够，扩增太长引物扩增效率会存在问题，导致不起峰或者 CT 值偏大。
A-B 为特异性好的引物，C-D 为物种嵌合标本引物扩增
2、标本质量问题
荧光定量 PCR 对于 RNA 质量有一定的要求，「质」 是第一位的，「量」 是第二位的，比较标准的 RNA 变性琼脂糖凝胶会呈现三条清晰带，自加样孔往下分别为：28S、18S 和 5S（5.8S 植物类），28S 条带亮度为 18S 的两倍。对于临床样本或者样本取材时不够规范，细胞培养有较多死细胞时，条带会呈现弥散状态，说明 totalNA 是有降解的，一般来说只要有明显的主带，RNA 进行逆转，进行 qPCR 是完全可以的。对于 FFPE 样本或者降解比较厉害的，那只能试试看，容易出现非特异性扩增或者 CT 值偏大。
样本抽提过程中新手容易出现误判，总害怕吸取的量不够，总害怕 RNA 量不够用，其实这是一个很大的误区，RNA“质” 不过关，即使再多量那也是无用的，因此样本抽提过程中，宁缺毋滥为宜，品质要放在第一位。
RNA 质量都没有问题，是不是荧光定量就不会存在问题呢？显然不完全对，RNA 质量没有问题，大部分荧光定量会比较顺利进行，但总会存在一些特例。比如做结肠炎模型时会用到葡聚糖硫酸钠（DSS），葡聚糖存在时，RNA 的逆转会明显受到抑制，导致荧光定量 PCR 模板量不够，CT 值偏大或者不起峰。因此对于类似葡聚糖硫酸钠处理的动物标本，RNA 抽提完毕后必须进行 RNA 的二次纯化，去除 RNA 酶的抑制剂，这样才能完整扩增。
E-G RNA 品质 ok，但因存在抑制逆转录酶活性物质，荧光定量扩增不理想，RNA 需纯化后进行逆转录
3、加样体系问题
加样过程是一个熟练度的问题，像卖油翁的活，「无他，唯手熟尔」，虽然快速上手不太容易，但总有一些方法可寻，可减少上样误差。主要举措有几点：
a、根据需要做的样本及基因，首先在 96 孔板或者 384 孔板做好相关的标记，将区域画好（图 H），同时做好设计图（图 I），加样时按图索骥，以免加样混淆；
b、将需要扩增的引物、PCRmix 事先混合好，混匀后，逐一按照加样表格上样，然后逐一加模板，完成整个上样过程。
c、可使用电动加样器/电动排枪等，减少人为加样误差。
上海卓立生物科技有限公司成立于 2011 年，注册资本 100 万元，公司位于上海市闵行区漕河泾高科技园 F 区，公司立足生命科学，为临床与基础研究领域的科学家提供分子生物学高端技术服务。经过多年发展，公司形成了以甲基化检测、组织芯片技术、蛋白芯片技术、基因芯片技术、二代测序技术为主体的高端技术服务体系。公司目前拥有 3 项授权专利（微孔板加样装置 专利号：ZL 2017 2 1628769.3 一种低温微孔板辅助加样系统 专利号：ZL 2017 2 1686865.5 组织芯片阵列设计软件 V1.0 专利号：2019SR0597907）。
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