随着质谱仪器的不断更新换代，蛋白组学的技术也不断的革新，从最早的 2-D 电泳技术到基于 LC-MSMS 的蛋白定性；从 Labelfree 技术到标记定量 iTRAQ/TMT 技术以及时下备受推崇的 DIA/SWATH 技术、PRM/MRM 技术，每一次的技术革新都使得蛋白组学研究更上一阶。蛋白 DIA 定量分析技术也被《Nature Methods》杂志评为最值得关注的技术之一；而 2018 年，《自然》将 SWATH 列为最值得关注的生物技术之一。该技术可谓蛋白组学研究的技术新潮。
生命科学的中心法则涉及了 DNA、RNA 和蛋白质，仅仅测量 DNA 和 RNA 难以获取关于生命活动的最直接信息，还需要蛋白质组大数据的参与。蛋白质组的复杂维度比基因组高好几个量级，需要更大的数据量才能深刻理解。如果我们有方法让各种组织细胞在病理生理状态下的蛋白质表达变成大数据，那将大大加强我们对生命的理解和对疾病的应对。当然，这样的话产生的蛋白质组大数据量级也将难以估量。
从生物学原理上看，蛋白质组的价值毋庸置疑。早在约 20 年前，全基因组测序完成后，在《科学》和《自然》杂志中，科学家们就兴奋地预言蛋白质组的时代已经到来。但直到现在，我们都很少看到蛋白质组对我们的生活或疾病诊疗产生实际的影响。这是因为蛋白质组面临很大的技术挑战，没有像基因测序技术那样的普及，这是一个卡住了全世界科学家脖子的难题。
理论上看，这个问题的答案肯定是 Yes，那为什么仍要提这个问题？因为蛋白质组发展了几十年，还没有一个能够被临床认证的生物标志物是由基于质谱技术的蛋白质组产生的。这是一个非常令人遗憾的事实。所幸，这并没有阻止科学家们探索的步伐，反而吸引越来越多的科学家涌向这一领域，希望用自己的创造力回答这个难题。
下面分享几个技术，可以在一定程度上应对这些技术挑战。
SWATH/DIA
SWATH/DIA 是最近几年兴起的质谱技术，所产生的谱图就像下图展示的那样：在某一时刻，数个不同颜色的多肽在同一时间区间出现，DIA产生混合谱图，能够将样本信息完全转化为数字信息。而传统的鸟枪法质谱只挑选出一些丰度较高的多肽分离出来打碎，样本中很多信息都未被采集，其定量准确性在同样的色谱条件下逊于 SWATH/DIA。
图像来源：SWATH 采集技术（非数据依赖型采集技术 (DIA) ）
https://sciex.com.cn/technology/swath-acquisition
DIA 技术是先利用常规DDA质谱检测技术分析建立图谱库，之后采用 DIA 方法进行质谱数据采集，从而实现对样品中蛋白质的定性及定量，不同于传统的DDA 技术，DIA 技术将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，因此可以无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息，数据利用度大大提高，缺失值更少。因此，DIA 技术更适合于大样本量、复杂体系的蛋白检测。
图 | DIA技术流程
DIA 技术优势
DIA技术较传统的 iTRAQ/TMT/Labelfree 蛋白组技术而言，具有如下优势：
1. 保证了数据的完整性，缺失值少。
2. 克服了 iTRAQ/TMT 的通量低的限制。
3. 提高了低丰度蛋白的检出率。
4. 鹿明生物基于 Thermo 公司的 QE-HF 高端质谱，检出率提升 20% 以上。
压力循环技术（PCT）
样本处理方法也很重要。多数临床样本为了能够长久保存，通常是经过福尔马林固定、石蜡包埋的坚硬的柱状组织，从中提取足够的多肽是一大难题。基于压力循环技术的新方法，可以从 1 立方毫米（1～2 毫克）的临床样品中提取 50～200 微克的多肽，能够做上百次质谱分析。整个流程可以在 3 小时内完成，足以满足大部分临床需求，这也大大降低了蛋白质组分析成本。
PCT 技术简介
PCT 技术是一种样品蛋白质组处理技术，通过在超高压和环境压力之间程序性周期性变换，诱导样品的基质和蛋白质溶解，促进并加速蛋白质酶解。对于临床样本，PCT还可以灭活潜在的传染微生物。PCT 技术具有速度快、损失少、操作简便、保真度高等特点。
PCT 优势
1、可处理特殊、珍贵、微量样本：石蜡包埋样本 (1 mg)、甲醛固定样本 (1 mg)、临床活检样本 (1 mg)、微量细胞样本（50 万）、花粉/鱼苗等（1 mg）；
2、高效的酶解效率；
3、损失少：PCT 处理 1 mg 样本（如小鼠肝脏）的产率高出传统方法的 40%；
4、操作简便：比传统样本处理方法减少近 10 步骤，仪器操作简单，误差小；
5、保真度高：Barocycle（超高压循环破碎仪）精确控制，有效地减少操作误差。
图 | PCT 辅助组织裂解和蛋白质酶解的肽段产量和效率
2018 年，《自然》将 SWATH 列为最值得关注的生物技术之一。鹿明生物也建立了一个非常高效的 PCT-SWATH/DIA 标准化流程。可将临床的大队列样品，通过高通量 PCT-SWATH/DIA 技术将检测信息转化成大数据。
那将样本处理 PCT 技术结合质谱检测技术 DIA 会产生怎样的火花呢？
PCT-DIA 结合
PCT 技术可最大限度地减少样品前处理的步骤，并且使样品损失最小化，可处理低量的珍贵样品。DIA 技术无通量限制，可用于大规模样本数量检测。将这两种技术强强结合，可实现针对石蜡/甲醛处理的组织样本及微量样本的蛋白组学分析，运用其通量高、稳定性强、速度快和精度高的特点，可解决微量样品难以分析蛋白质组的技术难题。当然，做完蛋白组学检测，您或许会想要进一步验证结果，高效的蛋白组 PRM 验证技术值得您关注。（技术详情可点此查看）
PCT-DIA 样本收集要求：
PCT-DIA 技术适用于石蜡样本、穿刺样本等蛋白组学研究~
应用领域
本篇由苏黎世联邦理工学院 Ruedi Aebersold 教授团队在 Nature Medicine 杂志（IF=30.641）发表题为“Rapid mass spectrometric conversion of tissue biopsy samples into permanent quantitative digital proteome maps”的研究论文，该研究提出了一个方法，可以快速稳定地将微量样本转化为一份数据文档，永久地存贮这个样本经质谱分析得到的蛋白质组结果。
DIA 技术简介
基本信息
【材料】组织活检样品
【主要技术】PCT-DIA(SWATH) 技术
【期刊】Nat.Med.
【影响因子】30.641
技术路线
1、建立 PCT-DIA(SWATH) 工作流程；
2、质谱分析；
3、利用 PCT-DIA(SWATH) 检测肾组织中蛋白质的动态范围；
4、PCT-DIA(SWATH) 检测肾组织蛋白质组的变异分析；
5、利用 PCT-DIA(SWATH) 进行肾肿瘤活检分型；
PCT-DIA 实验步骤（以 6 个样本为例）
步骤一：组织溶解与蛋白提取
将一批 6 个活检组织放入试管中并在 Barocycle（超高压循环破碎仪）中裂解。
步骤二：蛋白酶解
提取的蛋白质被还原和烷基化并稀释，利用 Barocycle（超高压循环破碎仪）促进酶解反应，C18 柱脱盐，真空干燥。总耗时约 6 小时。
步骤三：混样 DDA 建库
混合样品经过 SCX 分级，利用 DDA 扫描模式建库。
步骤四：DIA-MS分析
使用DIA扫描模式（即SWATH）进行谱图信息采集。
步骤五：图谱分析
将 DIA 扫描模式下获得的图谱信息与 DDA 建库信息进行比对，通过一系列的数据处理手段，获得蛋白定性和定量信息。
结果展示
图1 |不同技术重复之间的中位数变异系数（CV（%）<24%）
图2 |PCT-DIA技术验证其他文献中已发表的蛋白质标志物
图 3 |组间和组内的变异系数
PCT 技术是一种基于循环超高压的快速破碎微量样品的技术。具有速度快、损失少、操作简便、保真度高等特点，结合 SWATH（DIA 模式）的全范围扫描技术，特别适合大队列（几十上百甚至上千个样品）、少量样品（比如组织活检样品）蛋白组批量分析。文章采用 PCT-SWATH 技术，不仅能区分健康组织和肿瘤组织，还能实现对癌症的分子分型。该方法还可以应用于药物功能分析、分子功能分析等多个研究领域，是从蛋白组层面进行大队列分析的理想方法。
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