酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写 ELISA），是免疫学中的经典实验，指将可溶性的抗原或抗体结合到 Polystyrene 等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。
• ELISA 的原理
ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
• ELISA 的类型
ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：
（1）固相的抗原或抗体，即" 免疫吸附剂"（immunosorbent）；
（2）酶标记的抗原或抗体，称为「酶联物」、「结合物」（conjugate）；
（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。常用 ELISA 主要有以下几种类型：
（一） 双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如 HBsAg、HBeAg、AFP、hCG 等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。
（二）双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗 HBs 的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
（三）间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
（四）竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。
（五）竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等 ELISA 测定多用此法。
（六）捕获包被法测抗体
捕获法一般用来测定 IgM 类抗体。其基本原理是：将抗 IgM 抗体包被于固相微孔板，用无关蛋白载体对未结合位点进行封闭后，加入待测样本，接着加入抗原物质，然后加入针对该抗原的经生物素标记的特异性抗体和 HRP 标记的链霉亲和素，经 TMB 底物显色和终止反应后即可计算浓度。
由于我们检测样本中的 IgM 含量时，其中同时含有较高浓度的 IgG 类抗体，在用一般的间接法检测时，IgG 类抗体和 IgM 类抗体会和固相抗原进行竞争性结合，由于 IgG 占据绝对优势，势必导致 IgM 类抗体能够结合上去的量相当有限，最终导致的结果是假阴性。
（七）ABS-ELISA 法
ABS 为亲和素 (avidin) 生物素 (biotin) 系统 (system) 的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量 60000，每个分子由 4 个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量 244. 用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与 4 个生物素分子结合，因此如把 ABS 与 ELISA 法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原 ELISA 系统中的酶标抗体（抗原）。在 LAB 中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与 Polystyrene 载体的吸附性很强，用于 ELISA 中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在 ELISA 应用中有替代前者的趋势。由于 ABS-ELISA 较普通 ELISA 多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中 ABS-ELISA 应用不多。科研项目中检测微量的成分如细胞因子常采用本法。
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• ELISA 的原理
ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
• ELISA 的类型
ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：
（1）固相的抗原或抗体，即" 免疫吸附剂"（immunosorbent）；
（2）酶标记的抗原或抗体，称为「酶联物」、「结合物」（conjugate）；
（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。常用 ELISA 主要有以下几种类型：
（一） 双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如 HBsAg、HBeAg、AFP、hCG 等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。
（二）双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗 HBs 的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
（三）间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
（四）竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。
（五）竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等 ELISA 测定多用此法。
（六）捕获包被法测抗体
捕获法一般用来测定 IgM 类抗体。其基本原理是：将抗 IgM 抗体包被于固相微孔板，用无关蛋白载体对未结合位点进行封闭后，加入待测样本，接着加入抗原物质，然后加入针对该抗原的经生物素标记的特异性抗体和 HRP 标记的链霉亲和素，经 TMB 底物显色和终止反应后即可计算浓度。
由于我们检测样本中的 IgM 含量时，其中同时含有较高浓度的 IgG 类抗体，在用一般的间接法检测时，IgG 类抗体和 IgM 类抗体会和固相抗原进行竞争性结合，由于 IgG 占据绝对优势，势必导致 IgM 类抗体能够结合上去的量相当有限，最终导致的结果是假阴性。
（七）ABS-ELISA 法
ABS 为亲和素 (avidin) 生物素 (biotin) 系统 (system) 的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量 60000，每个分子由 4 个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量 244. 用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与 4 个生物素分子结合，因此如把 ABS 与 ELISA 法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原 ELISA 系统中的酶标抗体（抗原）。在 LAB 中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与 Polystyrene 载体的吸附性很强，用于 ELISA 中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在 ELISA 应用中有替代前者的趋势。由于 ABS-ELISA 较普通 ELISA 多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中 ABS-ELISA 应用不多。科研项目中检测微量的成分如细胞因子常采用本法。
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