肺癌是目前世界范围内最常见恶性肿瘤之一，随着科技技术的不断进步，肺癌治疗的方法也在不断更新。其中，因分子靶向治疗疗效明显及药物毒副作用小等优势，分子靶向检测及靶向药物治疗备受关注。现在，中国有大约 70% 非鳞状 NSCLC 患者接受 EGFR、ALK、ROS1 等基因药敏分子靶点检测 [1]，然而，EGFR 基因突变在 ARMS-PCR 临床检测过程中仍遇到一些难题，下面就几个难题进行简单剖析。

ARMS-PCR 临界结果判读

根据临床检测大数据汇总分析，有 5%- 10% 病例的 EGFR 突变丰度处在 5% 以下，这就造成了一部分患者的检测结果处于临界状态。任何技术平台都会存在类似的问题，如 EGFR ARMS-PCR 检测过程中出现了临界结果，可采用 ARMS-PCR 技术平台平行重复实验确认，也可采用与 ARMS-PCR 技术平台灵敏度相当的 NGS、dPCR 技术平台进行验证。

胞嘧啶脱氨（碱基 C>T）假阳性

有研究发现，同一组患者 FFPE 和冰冻组织标本中，FFPE 标本的 EGFR T790M 阳性率为 41.7%，而冰冻组织标本仅 2.8%。其原因是 C>T 假突变导致了 EGFR c.2369C>T（p.Thr790Met）的假阳性结果 [2]。我们也在 2018 年多家室间质评机构中 NGS 验证数据发现：检出已知结果外的多例极低丰度 T790M 突变，其中 EMQN 比例达 11.7%（7 / 60）。有临床实验室通过提取充分高温减少交联或使用 UDG 酶处理，可减少 60%- 80% 的 C>T 假突变 [3]。
 

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EGFR 基因扩增致基因拷贝数增多

最近发表的一项国外研究就调查了 114 例肺鳞癌和大细胞肺癌患者。共有 104 名男性和 10 名女性，中位年龄为 65 岁（范围 35 至 84 岁）。大多数患者临床特征是鳞状细胞癌类型（87%），有吸烟史（91%），病理分期 II 期（43%）和手术切缘阴性（92%）。通过 FISH（原位免疫荧光杂交）评估 EGFR 基因拷贝数，在 39.5% 的患者中检测到 EGFR FISH 阳性（EGFR 基因扩增）[4]。EGFR 基因扩增带来的基因拷贝数增多会导致在 EGFR ARMS-PCR 检测过程中对试剂的特异性产生影响，可能会造成结果较难判定。这时，可以通过降低核酸上机浓度进行复核。
 

 

检测标本本身质量不佳

根据临床实际应用汇总，EGFR ARMS-PCR 检测过程中遇到的标本质量问题包括有：甲醛.溶液过度固定导致组织 DNA 严重片段化、细胞学标本不经过病理质控和肿瘤细胞含量质控、新鲜冰冻组织样本无法准确评估样本中肿瘤细胞比例、钙化组织强酸脱钙等。强酸可以使组织标本快速脱钙，可进行组织学评价，但不适合 ARMS-PCR 检测 [5]。EGFR 临床标本检测要求可参考《中国非小细胞肺癌患者 EGFR+T790M 基因突变检测专家共识（2018 版）》。

血浆 T790M 检测阴性而又无法获取组织标本的困境

国内外权威指南与共识均推荐 T790M 突变检测组织优先。2017 年 NCCN V9 指南建议：NSCLC 患者接受吉非替尼、厄洛替尼或阿法替尼等一代或二代 EGFR-TKI 治疗后发生耐药进展均应及时进行 T790M 突变检测，检测时优先进行组织检测，若组织活检不可及时，再考虑血浆检测，如果血浆 T790M 检测阴性，推荐重新进行基于组织的检测；2017 年 CSCO 指南也指出「对于 EGFR-TKI 耐药病例，建议二次活检进行继发耐药 EGFR T790M 检测 (ARMS 方法，获批试剂盒)；对于不能获取组织的患者，可行血浆 ctDNA EGFRT790M 检测。
 

T790M 基因突变检测路径推荐

根据临床实际情况，很可能出现血浆 T790M 检测阴性而又无法获取组织标本的困境，这时该怎么办？根据《中国非小细胞肺癌患者 EGFR+T790M 基因突变检测专家共识（2018 版）》专家共识，我们可考虑肿瘤细胞学标本、脑脊液或者尿液等标本 [3]。

细胞学样本也适用于 EGFR T790M 突变检测。研究报道既往接受 EGFR-TKI 治疗的 EGFR 突变阳性 NSCLC 患者的组织学及细胞学样本检测 T790M 突变一致性达到 91.7%。无论采用哪种标本类型，均应保证包含足够的肿瘤细胞 (推荐肿瘤细胞数量在 200 个以上)，尽量剔除非肿瘤组织和细胞。2017 年，美国病理学家协会 (CAP)、国际肺癌研究协会 (IASLC)、美国分子病理学会 (AMP) 联合更新的分子检测指南中推荐病理医师可以使用细胞团块或其他细胞学标本作为肺癌分子检测的合适标本。

对于不能获取组织、血液或细胞学样本的患者，还可收集脑脊液或尿液，抽提 ctDNA，用于 EGFR T790M 突变检测。尿液样本提取的 ctDNA 也可用于 T790M 检测，尿液 T790M 阳性的患者接受三代 EGFR-TKI 治疗后的 ORR 和中位 PFS 与组织阳性患者相似 [6]。

 

注：(A) Duration of response (DOR). (B)Progression-freesurvival (PFS).
 

[1] Yong Song,Yi-Long Wu,et al.Factors associated with gene aberration teststatus and treatment decision in patients with unresectable Stage IIIB/IVnonsquamous non-small cell lung cancer: A multicenter survey in China (CTONG1506). Lung Cancer 123 (2018) 7 - 13.

[2] Ye X,Zhu ZZ,Zhong L,et al.High T790MDetection Rate in TKI-Naive NSCLC with EGFR Sensitive Mutation_ Truth or Artifact?JThorac Oncol,2013,8:1118 - 1120.

[3] 中国非小细胞肺癌患者 EGFR+T790M 基因突变检测专家共识（2018 版）.

[4] Hyun Chang,et al.Epidermal Growth FactorReceptor Gene Amplification Predicts Worse Outcome in Patients with SurgicallyResected Non-Adenocarcinoma Lung Cancer,Clinical Lung Cancer (2018), doi:10.1016 /j.cllc.2018.06.003.

[5] 李金明. 高通量测序技术.

[6] Jonathan W. Goldman, Chris Karlovich, Lecia V. Sequist et al.EGFRGenotyping of Matched Urine, Plasma, and Tumor Tissue in Patients WithNon–Small-Cell Lung Cancer Treated With Rociletinib, an EGFR Tyrosine KinaseInhibitor.JCO™ Precision Oncology.