10 月 2 日下午 17:30 诺贝尔生理学或医学奖正式公布，Jeffrey C. Hall, Michael Rosbash 和 Michael W. Young 因发现控制昼夜节律的机制而获奖。而前段时间刚公布了今年国自然的结果，基金委也是在前几天正式发布相信有很多小伙伴已经在考虑明年本子的内容了，并且想蹭一下今年诺奖的热点。那么如何科学的蹭热点呢？今天小拜就为大家梳理一下生物钟的机制并结合文章实例看一下生物钟相关的研究如何开展，并为大家整理了 16 年以来中标的所有涉及生物钟的 NSFC 项目信息。
生物钟的分子机制
在上世纪 70 年代，加州理工学院的 Seymour Benzer 和他的学生 Ronald Konopka 通过研究果蝇找到了控制果蝇昼夜节律的基因-per(period)。随后美国布兰达斯大学的分子生物学教授 Michael Rosbash 和遗传学教授 Jeffrey Hall 在 1984 年从果蝇中克隆到了 per 基因。洛克菲勒大学的 Michael W. Young 也在同一时期拿到了 per 基因克隆。之后 Jeffrey Hall 和 Michael Rosbash 发现果蝇体内周期基因的核糖核酸（mRNA）和蛋白水平呈昼夜节律性变动-PER 在夜间积累而在白天降解。PER 蛋白水平在 24 小时中的变化与昼夜规律同步。之后 Michael W. Young 的实验室在 1994 年发现了另一个核心生物钟基因 Timeless（tim）。它产生的表达产物 TIM 蛋白，对 PER 蛋白的表达有着重要的补充调节作用。
具体机制阐述如下：
细胞核内活化的 per 基因能够转录生成 mRNA，PER 蛋白在胞质内稳定存在并积累，在夜晚达到最大浓度并进入细胞核。在细胞核内 PER 蛋白能够抑制自身基因转录。而在早晨的时候 PER 蛋白会降解，几小时之后所有 PER 蛋白消失并解除对 per 基因的抑制，PER 蛋白的生成重新开始。
per 基因的转录需要 CYCLE（CYC）和 CLOCK（CLK）蛋白结合到 per 基因的启动子才能够进行。在夜晚的时候 CYC/CLK 复合物能够结合到启动子位置并诱导 per 基因转录。而当 PER 蛋白与 CYC/CLK 复合物直接作用之后会抑制转录过程的进行。在早晨的时候 PER 蛋白分解，解除对 CYC/CLK 复合物的抑制，转录重新开始。
tim 基因与 per 基因都能够被 CYC/CLK 复合物活化。转录生成的 TIM 蛋白与 PER 蛋白形成二聚体抑制 PER 蛋白的降解。PER/TIM 复合物进入细胞核与 CYC/CLK 复合物产生直接相互作用并抑制 tim 与 per 基因的转录。日出之后 TIM 蛋白会降解并导致 TIM 蛋白随之降解。基因的抑制作用解除，转录继续。
果蝇 doubletime 蛋白（DBT）通过磷酸化 PER 蛋白降解，在 PER 蛋白与 TIM 蛋白结合之后 PER 蛋白却无法被 DBT 降解。日出之后会引起果蝇眼内的感光的隐花色素异构化，并使之活化。活化的隐花色素能够诱导 TIM 蛋白降解。由于 TIM 蛋白降解，PER 蛋白无法保持稳定而随之被降解。突变的 DBT 蛋白会导致昼夜节律延长。
文章解读
好了，了解完机制，就让我们找篇文章来看看如何开展相关研究吧！小拜为大家找了一篇南开大学张晓东教授的文章，该篇文章题目为 A Long Noncoding RNA Perturbs the Circadian Rhythm of Hepatoma Cells to Facilitate Hepatocarcinogenesis，翻译一下就是 LncRNA 在肝癌细胞中扰乱昼夜节律从而促进了肝癌发生。在这里为大家总结的 ABCD 模式？而从题目来看该篇是 A（LncRNA）通过 B（扰乱昼夜节律）在 C（肝癌）中起到 D（促进肝癌发生）功能。所以大家平时读文献时多注意就会发现，很多文章的套路都差不多。
好了，闲话少述，我们切入正题，来看一下该文是如何开展相应实验的！
1. 首先作者通过前期实验发现 LncRNA HULC 在肝癌中高表达，而 CLOCK 是昼夜节律中比较关键的组份，两者是否会有一腿呢？这里就涉及到了我们研究基因功能常用的两种手段了：过表达和干扰！作者首先过表达了 LncRNA HULC，发现果然与 CLOCK 有一腿，HULC 过表达时 CLOCK 被上调了！而干扰掉 HULC 后 CLOCK 也相应会被下调！这就比较有意思了，于是作者又测了一下下游的靶基因 PER1 和 CRY1，发现也会有相应的变化！而作者又在 24 h 内分时段检测了一下发现在不同细胞中发生作用的时间还略有不同！L-O2 在 4 h 之后就会有明显的变化，而 HepG2 要 8 h。
2. 前期工作基础有了，接下来按部就班按照 LncRNA 研究的套路来做就可以了。所以接下来就是双萤光素酶实验了。作者首先通过预测发现 HULC 与 CLOCK 的 5'-UTR 区有一个 16 nt 的互补序列，于是作者将这一段互补序列做了一个突变（HULC-mut-in），为了让实验更加严谨，作者还在互补区旁边也做了一个突变（HULC-mut-out）作为对照，大家在做相关实验时也可以参考这个实验设计！结果显而易见，突变互补区 HULC 就没办法调控 CLOCK 了，而突变旁边的区域则没有什么卵用了！
3. 突变完 LncRNA 又来突变 CLOCK 的 5'-UTR 来了，也是过表达和敲减齐上阵！
4. 以上结果都有了，那么就来看看临床上的相关性吧！嗯，很给面子，正相关！
5. 其实以上实验做完，基本就确定 HULC 与 CLOCK 确实有关也有意义了，接下来就更简单了。FACs、克隆形成、微球体形成……做完这些，细胞功能实验也有了。
6. 要想提高文章的逼格，动物实验必不可少！而该类文章最最最常用的莫过于裸鼠成瘤了！来，各位小伙伴，请大声告诉我，这篇文章是不是炒鸡简单！国自然申请要想中标大部分都是需要有前期工作基础的，如果想着明年中标，不妨现在就准备起来，另外请为下面这些神人献上你的膝盖，他们已经在今年国自然中成功命中诺奖热点！
以上讲述完毕，那么小伙伴们明年课题有了么？小拜为您精心挑选了 10 个比较热门的领域，总结了一些热门选题和技术，这些文献读一下，会对您明年的课题申请有很大帮助的哦！
1、RNA 甲基化测序，阅读文献：m6Amodulates haematopoietic stem and progenitor cell specification（国自然热门选题和热门技术）
2、外泌体，阅读文献：Cancer-cell-secreted exosomal miR-105 promotes tumour growth throughthe MYC-dependent metabolic reprogramming of stromal cells（国自然热门选题）
3、小分子抑制剂，阅读文献：HER kinase inhibition in patients with HER2- and HER3-mutant cancers（国自然热门选题）
4、免疫检查点，阅读文献：Blockade of the checkpoint receptor TIGIT prevents NK cellexhaustion and elicits potent anti-tumor immunity（国自然热门选题）
5、炎症免疫，阅读文献：Hepatocyte-secreted DPP4 in obesity promotes adipose inflammationand insulin resistance
6、肠道微生物，阅读文献：Hypoxia induces senescence of bone marrow mesenchymal stem cells viaaltered gut microbiota（国自然热门选题）
7、PD-L1，阅读文献：TGFβattenuates tumour response to PD-L1 blockade by contributing to exclusion of Tcells（国自然热门选题）
8、单细胞测序，阅读文献：Global characterization of T cells in non-small-cell lung cancer bysingle-cell sequencing（热门技术）
9、肿瘤免疫，阅读文献：A natural killer–dendritic cell axis defines checkpointtherapy–responsive tumor microenvironments（国自然热门选题）
10、肿瘤微环境，阅读文献：Aspartate is a limiting metabolite for cancer cell proliferationunder hypoxia and in tumours
生物钟的分子机制
在上世纪 70 年代，加州理工学院的 Seymour Benzer 和他的学生 Ronald Konopka 通过研究果蝇找到了控制果蝇昼夜节律的基因-per(period)。随后美国布兰达斯大学的分子生物学教授 Michael Rosbash 和遗传学教授 Jeffrey Hall 在 1984 年从果蝇中克隆到了 per 基因。洛克菲勒大学的 Michael W. Young 也在同一时期拿到了 per 基因克隆。之后 Jeffrey Hall 和 Michael Rosbash 发现果蝇体内周期基因的核糖核酸（mRNA）和蛋白水平呈昼夜节律性变动-PER 在夜间积累而在白天降解。PER 蛋白水平在 24 小时中的变化与昼夜规律同步。之后 Michael W. Young 的实验室在 1994 年发现了另一个核心生物钟基因 Timeless（tim）。它产生的表达产物 TIM 蛋白，对 PER 蛋白的表达有着重要的补充调节作用。
具体机制阐述如下：
细胞核内活化的 per 基因能够转录生成 mRNA，PER 蛋白在胞质内稳定存在并积累，在夜晚达到最大浓度并进入细胞核。在细胞核内 PER 蛋白能够抑制自身基因转录。而在早晨的时候 PER 蛋白会降解，几小时之后所有 PER 蛋白消失并解除对 per 基因的抑制，PER 蛋白的生成重新开始。
per 基因的转录需要 CYCLE（CYC）和 CLOCK（CLK）蛋白结合到 per 基因的启动子才能够进行。在夜晚的时候 CYC/CLK 复合物能够结合到启动子位置并诱导 per 基因转录。而当 PER 蛋白与 CYC/CLK 复合物直接作用之后会抑制转录过程的进行。在早晨的时候 PER 蛋白分解，解除对 CYC/CLK 复合物的抑制，转录重新开始。
tim 基因与 per 基因都能够被 CYC/CLK 复合物活化。转录生成的 TIM 蛋白与 PER 蛋白形成二聚体抑制 PER 蛋白的降解。PER/TIM 复合物进入细胞核与 CYC/CLK 复合物产生直接相互作用并抑制 tim 与 per 基因的转录。日出之后 TIM 蛋白会降解并导致 TIM 蛋白随之降解。基因的抑制作用解除，转录继续。
果蝇 doubletime 蛋白（DBT）通过磷酸化 PER 蛋白降解，在 PER 蛋白与 TIM 蛋白结合之后 PER 蛋白却无法被 DBT 降解。日出之后会引起果蝇眼内的感光的隐花色素异构化，并使之活化。活化的隐花色素能够诱导 TIM 蛋白降解。由于 TIM 蛋白降解，PER 蛋白无法保持稳定而随之被降解。突变的 DBT 蛋白会导致昼夜节律延长。
文章解读
好了，了解完机制，就让我们找篇文章来看看如何开展相关研究吧！小拜为大家找了一篇南开大学张晓东教授的文章，该篇文章题目为 A Long Noncoding RNA Perturbs the Circadian Rhythm of Hepatoma Cells to Facilitate Hepatocarcinogenesis，翻译一下就是 LncRNA 在肝癌细胞中扰乱昼夜节律从而促进了肝癌发生。在这里为大家总结的 ABCD 模式？而从题目来看该篇是 A（LncRNA）通过 B（扰乱昼夜节律）在 C（肝癌）中起到 D（促进肝癌发生）功能。所以大家平时读文献时多注意就会发现，很多文章的套路都差不多。
好了，闲话少述，我们切入正题，来看一下该文是如何开展相应实验的！
1. 首先作者通过前期实验发现 LncRNA HULC 在肝癌中高表达，而 CLOCK 是昼夜节律中比较关键的组份，两者是否会有一腿呢？这里就涉及到了我们研究基因功能常用的两种手段了：过表达和干扰！作者首先过表达了 LncRNA HULC，发现果然与 CLOCK 有一腿，HULC 过表达时 CLOCK 被上调了！而干扰掉 HULC 后 CLOCK 也相应会被下调！这就比较有意思了，于是作者又测了一下下游的靶基因 PER1 和 CRY1，发现也会有相应的变化！而作者又在 24 h 内分时段检测了一下发现在不同细胞中发生作用的时间还略有不同！L-O2 在 4 h 之后就会有明显的变化，而 HepG2 要 8 h。
2. 前期工作基础有了，接下来按部就班按照 LncRNA 研究的套路来做就可以了。所以接下来就是双萤光素酶实验了。作者首先通过预测发现 HULC 与 CLOCK 的 5'-UTR 区有一个 16 nt 的互补序列，于是作者将这一段互补序列做了一个突变（HULC-mut-in），为了让实验更加严谨，作者还在互补区旁边也做了一个突变（HULC-mut-out）作为对照，大家在做相关实验时也可以参考这个实验设计！结果显而易见，突变互补区 HULC 就没办法调控 CLOCK 了，而突变旁边的区域则没有什么卵用了！
3. 突变完 LncRNA 又来突变 CLOCK 的 5'-UTR 来了，也是过表达和敲减齐上阵！
4. 以上结果都有了，那么就来看看临床上的相关性吧！嗯，很给面子，正相关！
5. 其实以上实验做完，基本就确定 HULC 与 CLOCK 确实有关也有意义了，接下来就更简单了。FACs、克隆形成、微球体形成……做完这些，细胞功能实验也有了。
6. 要想提高文章的逼格，动物实验必不可少！而该类文章最最最常用的莫过于裸鼠成瘤了！来，各位小伙伴，请大声告诉我，这篇文章是不是炒鸡简单！国自然申请要想中标大部分都是需要有前期工作基础的，如果想着明年中标，不妨现在就准备起来，另外请为下面这些神人献上你的膝盖，他们已经在今年国自然中成功命中诺奖热点！
以上讲述完毕，那么小伙伴们明年课题有了么？小拜为您精心挑选了 10 个比较热门的领域，总结了一些热门选题和技术，这些文献读一下，会对您明年的课题申请有很大帮助的哦！
1、RNA 甲基化测序，阅读文献：m6Amodulates haematopoietic stem and progenitor cell specification（国自然热门选题和热门技术）
2、外泌体，阅读文献：Cancer-cell-secreted exosomal miR-105 promotes tumour growth throughthe MYC-dependent metabolic reprogramming of stromal cells（国自然热门选题）
3、小分子抑制剂，阅读文献：HER kinase inhibition in patients with HER2- and HER3-mutant cancers（国自然热门选题）
4、免疫检查点，阅读文献：Blockade of the checkpoint receptor TIGIT prevents NK cellexhaustion and elicits potent anti-tumor immunity（国自然热门选题）
5、炎症免疫，阅读文献：Hepatocyte-secreted DPP4 in obesity promotes adipose inflammationand insulin resistance
6、肠道微生物，阅读文献：Hypoxia induces senescence of bone marrow mesenchymal stem cells viaaltered gut microbiota（国自然热门选题）
7、PD-L1，阅读文献：TGFβattenuates tumour response to PD-L1 blockade by contributing to exclusion of Tcells（国自然热门选题）
8、单细胞测序，阅读文献：Global characterization of T cells in non-small-cell lung cancer bysingle-cell sequencing（热门技术）
9、肿瘤免疫，阅读文献：A natural killer–dendritic cell axis defines checkpointtherapy–responsive tumor microenvironments（国自然热门选题）
10、肿瘤微环境，阅读文献：Aspartate is a limiting metabolite for cancer cell proliferationunder hypoxia and in tumours
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