实验简介
BCA（Bicinchoninic acid）法是目前应用比较广泛的蛋白质浓度测定方法。基于双缩脲反应，即在碱性环境下蛋白质将 Cu2+还原成 Cu+，Cu+ 与 BCA 试剂形成紫颜色的络合物，在 562nm 处有高的吸光值，该反应产物的量与蛋白质浓度成正比。测定其在 562nm 处的吸光值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。该方法快速灵敏、稳定可靠且对不同种类蛋白质变异系数很小。试剂盒中提供了浓度稳定的蛋白标准品用于制作标准曲线。
该 BCA 蛋白浓度测定试剂盒可用于试管法检测，也可用于微孔板法检测。试管法需较大量的蛋白样品（100μl）和工作液（2 mL），蛋白样品与 BCA 工作液的比率为 1:20（v/v），蛋白质测定范围为 20-2000 μg/ml，采用加强法可以检测到 5 μg/ml；微孔板法操作简单方便，仅需少量（10-25μl）的蛋白样品和工作液（200μl），蛋白样品与工作液的比率为 1:8（v/v）或者 1:20（v/v），蛋白质测定范围为 20-2000 μg/ml，采用加强法可以检测到 5 μg/ml。
材料与方法
试验方法
一、配制标准品和工作液
1、配制 BSA 标准品体系
注：BSA 标准品浓度为 2 mg/ml，稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用水或 1×PBS 进行稀释。
2. 配制 BCA 工作液
1) 计算所需要的总 BCA 工作液体积。
总 BCA 工作液体积=（标准品+待测样品）×重复数×每个样品所需要的 BCA 工作液
例如微孔板法检测 10 个样品的浓度，每个样品两次重复。则所需 BCA 工作液体积=（9+10）x 2 x 200ul =7.6 ml
注：试管法检测时每个样品加 2.0 ml BCA 工作液，微孔板检测每个样品加 200μl BCA 工作液。
2) 配制 BCA 工作液：50 体积的 BCA 试剂 A 中加入 1 体积的 BCA 试剂 B（A:B=50:1）, 充分混匀。例如 10 mlBCA 试剂 A 加 200ul BCA 试剂 B, 混匀, 配制成 10.2 ml BCA 工作液。
注： BCA 工作液装入密封容器内，室温条件 24 h 稳定。
二、蛋白浓度检测
1. 微孔板检测方法（样品：BCA 工作液=1:8）
1) 各取 25μl 标准品和待测样品加入到微孔板中。若待测样品不足 25ul，应用稀释液稀释样品补足 25ul。
注：样品与工作液比例为 1:8，若样品有限，可使用 10μl 标准品和待检测样品进行检测（即 1:20），这时试剂盒的检测范围为 125-2000 μg/ml。
2) 每孔加入 200μl BCA 工作液，枪头吹打充分混匀。盖上微孔板，37℃ 孵育 30 min。
3) 冷却到室温，在酶标仪上的 562nm 波长范围处检测吸光度。
4) 根据 BSA 标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的 OD 值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度 ug/ml；Y-最终的 OD562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
注：如果蛋白浓度过低，可增加孵育温度至 60℃30 min。如果待测样品中有干扰物，可增加 B 液比例至 50：2，并提高孵育温度至 60℃，可显著减少干扰物的干扰。
2. 试管检测方法（样品：BCA 工作液=1:20）
1) 各取 100μl 标准品和待测样品加入到反应管中。
2) 每管加入 2.0 ml BCA 工作液，混匀。根据待测样品的浓度范围选择孵育时间和温度。
标准孵育方法：37℃ 孵育 30 min 或者室温 2 h（检测范围：20-2000 μg/ml）
增强孵育方法：60℃ 孵育 30 min（检测范围：5-250 μg/ml）
注意： BCA 检测蛋白浓度，延长孵育时间会加深颜色反应。升高温度会加快显色反应。但是温度升高和
时间延长会降低检测下限，以及降低工作线性范围。若蛋白浓度很低，可在较高温度孵育或者适当延长孵育时间。
3) 冷却到室温。在分光光度计上进行检测，设定波长为 562nm，在 10 分钟内对所有样品读数。
注意：由于 BCA 反应达不到真正的反应终点，即使温度降低至室温生色反应液会继续。但是，由于室温下
生色比率相当低，因此若是 10 min 内能对所有的样本进行 562nm 吸光度的测试，不会导致明显错误。
4) 根据 BSA 标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的 OD 值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度 ug/ml；Y-最终的 OD562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
实验结果
待测样品蛋白浓度：a, 0.954 mg/ml; b, 1.553 mg/ml; c, 2.031 mg/ml
BCA（Bicinchoninic acid）法是目前应用比较广泛的蛋白质浓度测定方法。基于双缩脲反应，即在碱性环境下蛋白质将 Cu2+还原成 Cu+，Cu+ 与 BCA 试剂形成紫颜色的络合物，在 562nm 处有高的吸光值，该反应产物的量与蛋白质浓度成正比。测定其在 562nm 处的吸光值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。该方法快速灵敏、稳定可靠且对不同种类蛋白质变异系数很小。试剂盒中提供了浓度稳定的蛋白标准品用于制作标准曲线。
该 BCA 蛋白浓度测定试剂盒可用于试管法检测，也可用于微孔板法检测。试管法需较大量的蛋白样品（100μl）和工作液（2 mL），蛋白样品与 BCA 工作液的比率为 1:20（v/v），蛋白质测定范围为 20-2000 μg/ml，采用加强法可以检测到 5 μg/ml；微孔板法操作简单方便，仅需少量（10-25μl）的蛋白样品和工作液（200μl），蛋白样品与工作液的比率为 1:8（v/v）或者 1:20（v/v），蛋白质测定范围为 20-2000 μg/ml，采用加强法可以检测到 5 μg/ml。
材料与方法
- 试剂：BCA 蛋白浓度检测试剂盒
- 材料：293T 细胞、HCC-78 细胞、TC-1 细胞
试验方法
一、配制标准品和工作液
1、配制 BSA 标准品体系
注：BSA 标准品浓度为 2 mg/ml，稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用水或 1×PBS 进行稀释。
2. 配制 BCA 工作液
1) 计算所需要的总 BCA 工作液体积。
总 BCA 工作液体积=（标准品+待测样品）×重复数×每个样品所需要的 BCA 工作液
例如微孔板法检测 10 个样品的浓度，每个样品两次重复。则所需 BCA 工作液体积=（9+10）x 2 x 200ul =7.6 ml
注：试管法检测时每个样品加 2.0 ml BCA 工作液，微孔板检测每个样品加 200μl BCA 工作液。
2) 配制 BCA 工作液：50 体积的 BCA 试剂 A 中加入 1 体积的 BCA 试剂 B（A:B=50:1）, 充分混匀。例如 10 mlBCA 试剂 A 加 200ul BCA 试剂 B, 混匀, 配制成 10.2 ml BCA 工作液。
注： BCA 工作液装入密封容器内，室温条件 24 h 稳定。
二、蛋白浓度检测
1. 微孔板检测方法（样品：BCA 工作液=1:8）
1) 各取 25μl 标准品和待测样品加入到微孔板中。若待测样品不足 25ul，应用稀释液稀释样品补足 25ul。
注：样品与工作液比例为 1:8，若样品有限，可使用 10μl 标准品和待检测样品进行检测（即 1:20），这时试剂盒的检测范围为 125-2000 μg/ml。
2) 每孔加入 200μl BCA 工作液，枪头吹打充分混匀。盖上微孔板，37℃ 孵育 30 min。
3) 冷却到室温，在酶标仪上的 562nm 波长范围处检测吸光度。
4) 根据 BSA 标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的 OD 值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度 ug/ml；Y-最终的 OD562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
注：如果蛋白浓度过低，可增加孵育温度至 60℃30 min。如果待测样品中有干扰物，可增加 B 液比例至 50：2，并提高孵育温度至 60℃，可显著减少干扰物的干扰。
2. 试管检测方法（样品：BCA 工作液=1:20）
1) 各取 100μl 标准品和待测样品加入到反应管中。
2) 每管加入 2.0 ml BCA 工作液，混匀。根据待测样品的浓度范围选择孵育时间和温度。
标准孵育方法：37℃ 孵育 30 min 或者室温 2 h（检测范围：20-2000 μg/ml）
增强孵育方法：60℃ 孵育 30 min（检测范围：5-250 μg/ml）
注意： BCA 检测蛋白浓度，延长孵育时间会加深颜色反应。升高温度会加快显色反应。但是温度升高和
时间延长会降低检测下限，以及降低工作线性范围。若蛋白浓度很低，可在较高温度孵育或者适当延长孵育时间。
3) 冷却到室温。在分光光度计上进行检测，设定波长为 562nm，在 10 分钟内对所有样品读数。
注意：由于 BCA 反应达不到真正的反应终点，即使温度降低至室温生色反应液会继续。但是，由于室温下
生色比率相当低，因此若是 10 min 内能对所有的样本进行 562nm 吸光度的测试，不会导致明显错误。
4) 根据 BSA 标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的 OD 值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度 ug/ml；Y-最终的 OD562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
实验结果
待测样品蛋白浓度：a, 0.954 mg/ml; b, 1.553 mg/ml; c, 2.031 mg/ml
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