实验简介

质粒具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。是 DNA 重组技术中常用的载体，将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将其进行提取纯化，通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达。质粒是基因治疗、疫苗和转基因等必要手段。

内毒素（革兰氏阴性菌在死亡而溶解或用人工方法破坏菌体而释放），能够影响质粒转染的效率，影响转染过程中质粒 DNA 的吸收，也会激活免疫细胞中的非特异性免疫应答，干扰转染结果。因此，在质粒提取过程中，高效去除内毒素是至关重要步骤之一。

材料与方法

试剂：无内毒素质粒小量提取试剂盒
材料：含有 pEGFP-C1 质粒的 E.coli DH5α 菌液
方法：

1. 取 1-5 ml 菌液加入离心管（自备）中，最大转速离心 1 min，弃上清，收集沉淀。
2. 向菌体沉淀的离心管中加入 250μl 溶液 P1，使用涡旋振荡器或移液器等充分混匀，确保悬浮所有菌体沉淀。
3. 向上述离心管中加入 250μl 溶液 P2, 快速温和地上下颠倒混匀 6-8 次，使菌体完全裂解。
4. 向上述离心管中加入 350μl 溶液 P3，快速温和地上下颠倒混匀 6-8 次。此时出现大量白色絮状沉淀。12000rpm 离心 10 min。
5. 将步骤 4 中所得的上清液转移至吸附柱中，12000rpm 离心 1 min，倒掉废液，将吸附柱重新装回收集管中。
6. 向吸附柱中加入 500μl 溶液 PA，12000rpm 离心 1 min，倒掉废液。
7. 向吸附柱中加入 750μl 溶液 PE，12000rpm 离心 1 min，倒掉废液。
8. 重复步骤 7 一次。
9. 将吸附柱放回收集管中，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心 2 min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的 PE 影响下一步的实验。
10. 将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量溶液 EB（50-100μl）， 室温放置 2 min。12,000 rpm (~13,400×g ) 离心 1 min 收集质粒 DNA 溶液（请于-20℃ 保存）。

实验结果

质粒浓度 356ng/ul   A260=3.308  A280=1.746   260/280=1.89  260/230=2.33​​​​​​​