hello~大家好，又见面啦~

我是丰晖生物的分子技术支持：美露！

相信屏幕前的你，可能被 shRNA 干扰实验困扰了无数个日日夜夜......
亦或是屡屡想尝试，却次次与之失之交臂......
......被困扰的你是跪在哪一步了呢？
......而止步于起点的你又是因为什么呢？

欢迎收看本期的 走近科学节目!  文章！

今天写作这篇文章的目的呢，正是为帮助做实验的你缕清思路。让在干扰实验门口「探头」的你，系统的了解整个流程，从而让入门不再只是想象。

下面我要开始放大招了：

（一）shRNA 干扰机制＆shRNA 设计

shRNA（short/ small hairpin RNA）干扰机制图解

 

shRNA 组成：

shRNA 包括两个短的反向互补序列，中间由茎环（loop）序列分隔，组成发夹结构，随后连上 5～6 个 T（转录终止信号）

shRNA 设计：

1. 直接用软件设计：

BLOCK-iT™ RNAi 

Designer：
http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setOption.do?designOption=shrna&pid=5285499614803467247

Gene Link shRNA Design Guidelines：
http://www.genelink.com/sirna/shRNAi.asp

siDirect version 2.0：
http://sidirect2.rnai.jp/

CRISPR DESIGN：
http://crispr.mit.edu/

CRISPRfinder program online：
http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/

2. 手动设计，原则：

A. 首先靶位点选择应该避开基因的非编码区；

B. 在正义链和反义链序列上不能出现连续 3 个或以上的 T，这可能导致 shRNA 转录的提前终止；

C. Stratagene 发现 29 个寡核苷酸抑制目的基因表达的效率比 23 个寡核苷酸的高；

D. 在启动子下游的酶切位点下方紧连一个 C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生；

E. shRNA 目的序列的第一个碱基必须是 G 以确保 RNA 聚合酶转录。如果选择的目的序列不以 G 开头，必须在紧连正义链的上游加一个 G；

F. shRNA 插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央，比较了众多不同长度和序列的茎环，5'TTCAAGAGA3' 序列最为有效；

G.  5～6 个 T 必须放置在 shRNA 插入片段尾部以确保 RNA 聚合酶III终止转录；

shRNA 设计好并合成之后，通过同源重组或者是酶切连接的方法进行干扰载体构建，构建成功后大量抽提质粒（去内毒素且 OD260/OD280 最好在 1.8 左右），以备转染。

（二）转染＆WB/QPCR

干扰载体转染（脂质体介导法）

工艺流程

（可以点开保存大图↓）
 

收集细胞，分别提取总蛋白（用于 WB 检测蛋白水平）和总 RNA（逆转录成 cDNA 用于 QPCR 检测 RNA 水平）

WB工艺流程



QPCR检测工艺流程



好啦！今天的 shRNA 干扰实验的文章就到这里啦~

对文中的实验还有疑问的

可以加我的 QQ：1179810277

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我是丰晖生物的分子技术支持：美露

我们下期再见！



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