CRISPR protocol---CRISPR 中 gRNA 的设计
- 今天着重介绍几个在线设计 gRNA 的工具：
- 着重推荐Lei Stanley Qi Lab 的 http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp
这个在线站点功能比第一个丰富，可以选择基因编辑工具的其他用途（激活，抑制基因表达等）（图1-1）。下一步就是选择物种（图1-2）。但只有常见的 9 种。再下一步就是直接输入基因的名称（或序列）即可（图1-3）。
图1-1 选择编辑类型
图1-2 选择物种
图1-3 选择基因名称
但是出来的 sgRNA 位置有一些并不总在 ATG 的下游（图2所示，1，2，6，9，12，16，22 几条 sgRNA 位于 ATG 的上游）。所以根据位置，对于做基因的敲除（KO）而言，强烈建议选择 ATG 下游通常 100 aa 以内范围内的 sgRNA 来用（比如图3 中的 3，5，7，10 等较下游的）；而且，一定要位于 CCDS 区域内（CCDS 是 consensus CDS，即公共的 CDS 区域，是针对很多个转录本 [isoforms] 定义，图2 中路色条框即是。这个很重要！！！）。
图2
Feng Zhang lab：http://crispr.mit.edu/。 这是最早的一个设计站点。包括常见的 16 个物种。选中物种，把你要设计的区段序列扔到下面的框里运行就行。但前提是你自己已经选好了位置（图3）
图3
- 还有其他，如 omictools 下面的 Cas-Designer
http://www.rgenome.net/cas-designer/
这个站点内容更加丰富，比如物种覆盖式最多的，包括植物，昆虫等等（图4 左）。这个站点也是输入目的基因的序列定制的，不同的是可以有较大的自由度选择位置预测。
这个站点内容更加丰富，比如物种覆盖式最多的，包括植物，昆虫等等（图4 左）。这个站点也是输入目的基因的序列定制的，不同的是可以有较大的自由度选择位置预测。
图4
- 还有一些商业公司的，比如 Thermo 下面的（图5）：
https://apps.thermofisher.com/crispr/index.html#/search
物种较少，商业性目的特别强，了解下即可。
物种较少，商业性目的特别强，了解下即可。
图5
- 其实你只要 google 一下会发现特别多的设计工具，感兴趣的可以自行探索。
图6
一、手动版设计方法—好用不贵
手动版本虽然费事，但有时候却会事半功倍，节约后续鉴定单克隆的成本。我们举例来说：
手动版本虽然费事，但有时候却会事半功倍，节约后续鉴定单克隆的成本。我们举例来说：
图7
序列中 PAM 和 sgRNA 的序列放大如下（前提是 sgRNA 位于 CCDS 区域，而且特异性要保证）：
图8
也即我们常说的，让 Cas9 切割位置（确定的）跨过一个酶切位点（比如 sfcI）（在前两篇文章中都有所提及）。这样，在 Cas9 成功编辑靶序列产生 indels 的时候，酶切位点一定会遭到破坏。这为后续的单克隆鉴定提供了便利。请看示意图（图9）：
图9
注意一点：PCR 引物设计的时候确保 PCR 片段内部不要出现第二个 SfcI 的酶切位点。这样后面酶切的时候结果是唯一的。实验流程和鉴定结果应该是这样的（图10）：
图10
对于 WT，酶切是充分的，不会残留。而对于成功编辑的两个 mixture：*1和*2，由于产生了 indels，部分 sfcI 的位点造到破坏，sfcI 切不动的。对于成功编辑的单克隆而言，应该是一点都切不动。后续鉴定只要这样的克隆去测序即可（图11，红色编号为阳性克隆）。
图11
TA 克隆结果（图12）：
图12
- 其他 Cas9，比如 Cpf1 和 saCas9 的设计
打开页面，输入要编辑区域的基因组序列，然后在PAM类型里选择你需要的 Cas9 类型，比如 spCas9，saCas9 以及 cpf1 等。其他条件默认设置即可，然后点击 sunmit 即可。非常傻瓜式的操作（图12，13）
图12
图13
汉恒生物- Cas9试用装申请
汉恒生物- Cas9试用装申请
方式一：点击链接申请Cas-9免费试用装！
http://www.biomart.cn/try/4041/CRISPR-Cas9基因敲除病毒试用装.htm
http://www.biomart.cn/try/4041/CRISPR-Cas9基因敲除病毒试用装.htm
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