快速脂质体转染
脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层,又称为人工生物膜。实验者曾运用脂质体来模拟生物膜,研究膜的构造及功能,从而发现了膜的融合及内吞作用,在细胞转染实验中经常用作外源物质进入细胞的载体。
- 实验原理
用LR进行转染时,首先需要优化转染条件,应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等。先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从1-5ug和孵育时间6h,开始,按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线,再选用LR和DNA两者最佳的剂量,确定出转染时间(结果可参照表1所示)。
细胞种类:COS-7、BHK21、293E、SW480等均可作为受体细胞。脂质体本身会参与细胞生理活动,引起基因表达的上调或下调,因LR对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过24h为宜。 虽然人们早已发现脂质体对细胞有一定的影响,但由于一直没有更高效的转染方法来代替脂质体,所以脂质体转染试剂的选择非常重要。本人所用的转染剂为本人使用的是北京义翘神州的高效转染试剂Sinofection 0.75 ml,所用细胞为293Ecell。
- 实验步骤
2.转染液的制备:
(1)用无血清培养基于EP管中稀释0.2µgDNA至25μL,室温5分钟;
(2)往DNA稀释液中加入sinofection至50μL,混合均匀,室温放置15 ~20min。
3.将转染液加入DMEM+10%FBS, 5%CO2,37℃孵化培养4-6小时;
4.基因表达是在48-72h后测试。
表1 不同细胞系sinofection用法(96孔板)
Cell type | Culture medium | Cells per well | DNA | Sinofection | Medium change after 4-6h |
293H | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL | DMEM+10%FBS |
293FT | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL | DMEM+10%FBS |
293E | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL | DMEM+10%FBS |
293F | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL | DMEM+10%FBS |
COS7 | DMEM | 1.5×104 | 0.4µg | 0.5µL | DMEM+10%FBS |
hela | DMEM | 2×104 | 0.3µg | 0.5µL | 1640+15%FBS |
Caco2 | MEM | 3.5×104 | 0.3µg | 0.75µL | MEM+10%FBS |
BHK21 | MEM | 2×104 | 0.2µg | 0.5µL | MEM+10%FBS |
CHO-DG44 | DMEM+HT+pro | 2×104 | 0.5µg | 0.5µL | DMEM+HT+pro +10%FBS |
RAW264.7 | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL | DMEM +10%FBS |
MCF7 | MEM/NEAA+0.01mg/mL insulin + sodium pyruvat |
2×104 | 0.1µg | 0.25µL | MEM/NEAA+0.01mg/mL insulin + sodium pyruvat+10%FBS |
SW480 | IMDM | 3×104 | 0.4µg | 0.5µL | IMDM +10%FBS |
MDCK | DMEM | 4×104 | 0.6µg | 1µL | DMEM+10%FBS |
CHO-K1 | IMDM+Pro | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL | IMDM+Pro +10%FBS |
HepG2 | DMEM | 3×104 | 0.5µg | 0.75µL | DMEM+10%FBS |
A549 | DMEM | 2×104 | 0.3µg | 0.5µL | DMEM+10%FBS |
NIH/3T3 | DMEM | 1.5×104 | 0.1µg | 0.75µL | DMEM+10%FBS |
vero | DMEM | 3×104 | 0.3µg | 0.75µL | DMEM+10%FBS |
sf9 | SIM SF | 5×104 | 0.4µg | 0.75µL | SIM SF+10%FBS |
注意事项:注意保持 DNA量和ifectDNA体积比例( 1 μg DNA : 4 μL ifectDNA)
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