如何确定发光测量的微孔板间的交叉污染？
北京亘辰科技有限公司 Frank Han (本文为作者原创，谢绝转载）
数据来自：Stephen Knight BSc MA, Porvair Sciences Ltd, Leatherhead, England,
在过去十年中，发光实验具有非常高的特异性和在低水平的筛选化合物的良好灵敏度，方便易用，多应用于药物开发研究。 现代光度测量仪器能够准确地计数来自发光底物的非常低水平的光子发射，引起越来越多研究者对SBS / ANSI标准微板的设计中固有的光学干扰以及信噪比的关注。这篇短文比较了三个不同制造商的微孔板中的可观察到的光学干扰，发现使用黑色支持基质可以显着提高微板测定的灵敏度。
分光光度法
该研究比较了两种不同的制造商的固体白色聚苯乙烯矮板微孔板与获得专利的Porvair Sciences设计的白色单孔与实心黑色板基质的组合（图1）。用萤火虫荧光素酶的发光测定做对比。 有三种基于微孔板的样品获得有用的光学数据的基本方法。最简单的方法是吸光度测量。根据Beer-Lambert定律，给定化合物在溶液中的浓度与给定波长和恒定光程长度下吸收的光量子成正比。 因此，单色光束可以被引入到孔中，测量透射或吸收的光。简单的计算出每个孔中的相对浓度。大多数实验室酶标仪使用这种方法。
Figure 1. The unique Porvair black & white 96-well assay plate
当需要更高的灵敏度时，优选荧光测量。给定波长的激发光束被引入到孔中。荧光团从入射光吸收光子并重新发射较低能量的光子，因此出现较长的波长。在荧光计中，简单的截止滤波器可以用于从检测到的光中去除反射的激发波长，仅留下发射波长。灵敏度可以比简单的吸光度测量高10倍。通过使用单色仪降低激发和发射波长的带宽来实现更高的灵敏度。这种分光荧光计可以增加一个数量级的灵敏度。
生物发光是由某些动物和植物物种展示的自然发生的现象，可以通过两种常见机制发光，水母发光蛋白和萤光素途径。萤火虫甲虫（Lampyridae），海洋桡足类物种Metridia Longa和海堇（Renilla Reniformis）都包含类荧光素酶中的酶，其在ATP的存在下催化荧光素底物的氧化，引起光的发射。在水母科的发光水母中，底物水母发光蛋白在腔肠素和Ca 2+离子存在下被激发。在返回基态时，发射蓝光。这些反应被视为纯化学驱动的生物适应，称为化学发光。
通过用包括荧光素酶基因的通用构建体转染细胞，荧光素酶可以用作报告基因以评估细胞内的转录活性或提供用于在高通量筛选应用中测定细胞凋亡的细胞ATP水平的非常灵敏的测定。在这样的测定中，由克隆的荧光素酶系统发射连续光，并且可以研究其动力学并与例如可用ATP的浓度或细胞经历有丝分裂，保持稳定或响应于化学刺激经历细胞死亡。这种发光测定法由几个主要的生命科学公司以AequoScreen TM，LucLite TM，ATPLite TM，OneGlo TM的名称销售。通常用发光计或多标记读取仪检测，其是能够读取吸光度，荧光或发光模式的多用途光谱仪。在图2中按图示出了三种光学检测方法。
Figure 2: Photometric detection methods
微板设计考虑
用于检测开发和高通量筛选的微孔板通常由聚苯乙烯聚合物制造。向其中加入荧光增白剂，例如二氧化钛，以增加白板的板表面的反射率。此外，用于模制这些孔板的钢制工具被高度抛光以便在孔内提供非常光滑的光亮表面。这些属性确保孔内发射的光被反射回到微孔的顶部。灵敏的光学检测仪在此读取数据并定位。理想地检测器是光电倍增管或光电二极管将捕获大部分的发射光和反射光。
对于荧光检测，“淬灭”聚苯乙烯底物的天然自发荧光非常重要。通常通过向聚苯乙烯中加入1％的炭黑来实现。这在荧光测定中非常有效，并且在这些情况下可以得出比白板更好的结果。再次，所有的内表面被抛光以增加反射率。
当在筛选中使用荧光素酶在孔板上观察高动态范围出现困难时，相邻的孔可以显示非常强或非常弱的信号，并可能导致孔之间的光学干扰，因此得出错误的结果。一定量的可见光可以通过板的白色塑料壁“泄漏”尽管低信号也会在相邻孔板中被错误地附加而被检测到。当读取与低水平信号相邻的更亮的孔时，误差最大。虽然使用分离的“烟囱”孔板设计可以减少这种误差，但却不能消除误差。图3显示Porvair固体白色96-“烟囱孔”板（左手图片）。每个孔具有与板矩阵分离的单独形成的孔壁。
为了克服白色塑料的光通道问题，Porvair Sciences开发独特的96孔黑白板并获得了专利。（图3右图）。黑色聚苯乙烯板基体在“双射”工艺制造时具有单个白色单元模具。这种双射模具也用于将单个透明孔模制成白色或黑色矩阵，以使Porvair Sciences Krystal 2000TM零干扰板用于底部读取吸光度和荧光应用。
将其配方中含有高达18％TiO 2的亮白色孔板结合到1％炭黑基质中，在新板中的光学干扰全部被消除。该数据表明：Porvair与两个其他制造商的固体白色检测比较时，黑白板每孔间分别具有82％和56％的低干扰水平。
研究方法论
在BMG Labtech的POLARStar Omega多模式分光光度计上使用5ul含有荧光素和萤火虫荧光素酶的溶液移液到每个96孔板的孔C4中（在下面的数据中显示为“P”）并在510nm处读数。加入5μL等分的过氧化氢反应。为使发光信号随时间衰减，从每个样品孔周围的的空的孔中取出四个读数，每个读数持续1秒，并且取平均值。这些数据显示为“循环1,2,3和4”。每个循环表示自从进行第一次读取起经过的时间为1分钟。 这是必要的，因为荧光素酶信号在8-10分钟的时间段内快速衰减，因此获得读数，直到信号下降到初始水平的几乎50％。
Figure 3. Schematic showing the position of the sample and the various measurement positions around the sample.
读数取自四种不同类型的孔：X1 =与样品孔共享相同孔壁的孔；X2 =与样品孔共享相同角的孔；X3 =距离样品孔正好一个cell的孔；X4 =距离样品孔两个cell，位于在角落处的孔。
每个实验只准备一个板，注意从未打开的包装中仅选择新鲜的干净板。对于其他制造商的孔板重复该流程。使用相同类型的空白板做背景读数以进行信噪比计算。
结果
Porvair 96孔黑白板的计算信噪比为192000：1，而实心白板的信噪比为178000：1，显示在背景上有用的可测量信号增加7.5％。在最接近反应混合物的孔（细胞X1）中，在Porvair Sciences黑白板中测得的干仅为0.026％，而在其它两个实心白板中干扰为0.041％和0.048％，提高82％。
在发光干扰实验中，仅用缓冲液或水进行“空白”对照没有意义，因为看不到可观察到的信号。如果进行这样的实验，来自光电检测器的任何读数将导致杂散光进入样品室，或归因于“暗电流”，其表示来自检测器的元件和电子器件的连续量子噪声，由仪器固件自动校正。
结论
结果清楚地表明，Porvair科学的复合黑白板提供用于筛选和药物开发中低水平荧光素酶的测定。通过炭黑的有效猝灭和来自二氧化钛增白剂的增加反射率的组合产生改善信噪比和更优的板内动态范围，使筛选者有机会在较低的检测水平或减少试剂浓度下筛选较弱信号。
关于Porvaier-Sciences
Porvair-Sciences，微孔板产品的制造专家，服务生命科学，生物技术，医药研发和分子生物学的微孔板解决方案的所有应用，通过我们的全球分销网络向全世界科研用户提供从样品制备到高通量筛选的全方位产品。
我们的产品系列包括所有通用的真空歧管，密封剂，蒸发器和微量滴定板;深孔和浅孔存储板，测定板，荧光素酶报告基因板和液体处理试剂盘。我们还为生命科学研究提供定制微孔板。我们的真空歧管，对于96孔SPE样品制备至关重要，为各大品牌生物公司设计最通用的过滤板，包括Waters，Millipore，Qiagen，Whatman，GE Healthcare，Varian，Biotage、当然还有Porvair。
北京亘辰科技有限公司
Frank Han
Tel: 010-62917082；13810838040；13581771682
Email: 13810838040@163.com；info@genechain.net;
www.genechain.net;
北京亘辰科技有限公司 Frank Han (本文为作者原创，谢绝转载）
数据来自：Stephen Knight BSc MA, Porvair Sciences Ltd, Leatherhead, England,
在过去十年中，发光实验具有非常高的特异性和在低水平的筛选化合物的良好灵敏度，方便易用，多应用于药物开发研究。 现代光度测量仪器能够准确地计数来自发光底物的非常低水平的光子发射，引起越来越多研究者对SBS / ANSI标准微板的设计中固有的光学干扰以及信噪比的关注。这篇短文比较了三个不同制造商的微孔板中的可观察到的光学干扰，发现使用黑色支持基质可以显着提高微板测定的灵敏度。
分光光度法
该研究比较了两种不同的制造商的固体白色聚苯乙烯矮板微孔板与获得专利的Porvair Sciences设计的白色单孔与实心黑色板基质的组合（图1）。用萤火虫荧光素酶的发光测定做对比。 有三种基于微孔板的样品获得有用的光学数据的基本方法。最简单的方法是吸光度测量。根据Beer-Lambert定律，给定化合物在溶液中的浓度与给定波长和恒定光程长度下吸收的光量子成正比。 因此，单色光束可以被引入到孔中，测量透射或吸收的光。简单的计算出每个孔中的相对浓度。大多数实验室酶标仪使用这种方法。
Figure 1. The unique Porvair black & white 96-well assay plate
当需要更高的灵敏度时，优选荧光测量。给定波长的激发光束被引入到孔中。荧光团从入射光吸收光子并重新发射较低能量的光子，因此出现较长的波长。在荧光计中，简单的截止滤波器可以用于从检测到的光中去除反射的激发波长，仅留下发射波长。灵敏度可以比简单的吸光度测量高10倍。通过使用单色仪降低激发和发射波长的带宽来实现更高的灵敏度。这种分光荧光计可以增加一个数量级的灵敏度。
生物发光是由某些动物和植物物种展示的自然发生的现象，可以通过两种常见机制发光，水母发光蛋白和萤光素途径。萤火虫甲虫（Lampyridae），海洋桡足类物种Metridia Longa和海堇（Renilla Reniformis）都包含类荧光素酶中的酶，其在ATP的存在下催化荧光素底物的氧化，引起光的发射。在水母科的发光水母中，底物水母发光蛋白在腔肠素和Ca 2+离子存在下被激发。在返回基态时，发射蓝光。这些反应被视为纯化学驱动的生物适应，称为化学发光。
通过用包括荧光素酶基因的通用构建体转染细胞，荧光素酶可以用作报告基因以评估细胞内的转录活性或提供用于在高通量筛选应用中测定细胞凋亡的细胞ATP水平的非常灵敏的测定。在这样的测定中，由克隆的荧光素酶系统发射连续光，并且可以研究其动力学并与例如可用ATP的浓度或细胞经历有丝分裂，保持稳定或响应于化学刺激经历细胞死亡。这种发光测定法由几个主要的生命科学公司以AequoScreen TM，LucLite TM，ATPLite TM，OneGlo TM的名称销售。通常用发光计或多标记读取仪检测，其是能够读取吸光度，荧光或发光模式的多用途光谱仪。在图2中按图示出了三种光学检测方法。
Figure 2: Photometric detection methods
微板设计考虑
用于检测开发和高通量筛选的微孔板通常由聚苯乙烯聚合物制造。向其中加入荧光增白剂，例如二氧化钛，以增加白板的板表面的反射率。此外，用于模制这些孔板的钢制工具被高度抛光以便在孔内提供非常光滑的光亮表面。这些属性确保孔内发射的光被反射回到微孔的顶部。灵敏的光学检测仪在此读取数据并定位。理想地检测器是光电倍增管或光电二极管将捕获大部分的发射光和反射光。
对于荧光检测，“淬灭”聚苯乙烯底物的天然自发荧光非常重要。通常通过向聚苯乙烯中加入1％的炭黑来实现。这在荧光测定中非常有效，并且在这些情况下可以得出比白板更好的结果。再次，所有的内表面被抛光以增加反射率。
当在筛选中使用荧光素酶在孔板上观察高动态范围出现困难时，相邻的孔可以显示非常强或非常弱的信号，并可能导致孔之间的光学干扰，因此得出错误的结果。一定量的可见光可以通过板的白色塑料壁“泄漏”尽管低信号也会在相邻孔板中被错误地附加而被检测到。当读取与低水平信号相邻的更亮的孔时，误差最大。虽然使用分离的“烟囱”孔板设计可以减少这种误差，但却不能消除误差。图3显示Porvair固体白色96-“烟囱孔”板（左手图片）。每个孔具有与板矩阵分离的单独形成的孔壁。
为了克服白色塑料的光通道问题，Porvair Sciences开发独特的96孔黑白板并获得了专利。（图3右图）。黑色聚苯乙烯板基体在“双射”工艺制造时具有单个白色单元模具。这种双射模具也用于将单个透明孔模制成白色或黑色矩阵，以使Porvair Sciences Krystal 2000TM零干扰板用于底部读取吸光度和荧光应用。
将其配方中含有高达18％TiO 2的亮白色孔板结合到1％炭黑基质中，在新板中的光学干扰全部被消除。该数据表明：Porvair与两个其他制造商的固体白色检测比较时，黑白板每孔间分别具有82％和56％的低干扰水平。
研究方法论
在BMG Labtech的POLARStar Omega多模式分光光度计上使用5ul含有荧光素和萤火虫荧光素酶的溶液移液到每个96孔板的孔C4中（在下面的数据中显示为“P”）并在510nm处读数。加入5μL等分的过氧化氢反应。为使发光信号随时间衰减，从每个样品孔周围的的空的孔中取出四个读数，每个读数持续1秒，并且取平均值。这些数据显示为“循环1,2,3和4”。每个循环表示自从进行第一次读取起经过的时间为1分钟。 这是必要的，因为荧光素酶信号在8-10分钟的时间段内快速衰减，因此获得读数，直到信号下降到初始水平的几乎50％。
Figure 3. Schematic showing the position of the sample and the various measurement positions around the sample.
读数取自四种不同类型的孔：X1 =与样品孔共享相同孔壁的孔；X2 =与样品孔共享相同角的孔；X3 =距离样品孔正好一个cell的孔；X4 =距离样品孔两个cell，位于在角落处的孔。
每个实验只准备一个板，注意从未打开的包装中仅选择新鲜的干净板。对于其他制造商的孔板重复该流程。使用相同类型的空白板做背景读数以进行信噪比计算。
结果
Porvair 96孔黑白板的计算信噪比为192000：1，而实心白板的信噪比为178000：1，显示在背景上有用的可测量信号增加7.5％。在最接近反应混合物的孔（细胞X1）中，在Porvair Sciences黑白板中测得的干仅为0.026％，而在其它两个实心白板中干扰为0.041％和0.048％，提高82％。
在发光干扰实验中，仅用缓冲液或水进行“空白”对照没有意义，因为看不到可观察到的信号。如果进行这样的实验，来自光电检测器的任何读数将导致杂散光进入样品室，或归因于“暗电流”，其表示来自检测器的元件和电子器件的连续量子噪声，由仪器固件自动校正。
结论
结果清楚地表明，Porvair科学的复合黑白板提供用于筛选和药物开发中低水平荧光素酶的测定。通过炭黑的有效猝灭和来自二氧化钛增白剂的增加反射率的组合产生改善信噪比和更优的板内动态范围，使筛选者有机会在较低的检测水平或减少试剂浓度下筛选较弱信号。
关于Porvaier-Sciences
Porvair-Sciences，微孔板产品的制造专家，服务生命科学，生物技术，医药研发和分子生物学的微孔板解决方案的所有应用，通过我们的全球分销网络向全世界科研用户提供从样品制备到高通量筛选的全方位产品。
我们的产品系列包括所有通用的真空歧管，密封剂，蒸发器和微量滴定板;深孔和浅孔存储板，测定板，荧光素酶报告基因板和液体处理试剂盘。我们还为生命科学研究提供定制微孔板。我们的真空歧管，对于96孔SPE样品制备至关重要，为各大品牌生物公司设计最通用的过滤板，包括Waters，Millipore，Qiagen，Whatman，GE Healthcare，Varian，Biotage、当然还有Porvair。
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