| 现象 | 原因 | 解决 |
| 反影（白色条带，黑色背景） | 1、 HRP过高（背景较高） | 至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍） *注1 |
| 显影后膜上条带处变为黄色 | 2、 HRP过高（敏感性太高） | 至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍） *注2 |
| 信号弱或无 | 3、 HRP过高引起底物迅速耗竭 | 至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍） *注3 |
| 4、 抗体-抗原系统敏感性过低 | 提高抗体浓度/蛋白上样量 *注4 | |
| 5、 转膜不充分/过转 | 优化转膜条件 *注5 | |
| 6、 HRP或底物活性降低 | 测试活性或选用敏感底物 *注6 | |
| 7 、高背景 | 提高抗体浓度 *注7 |
一、反影（白色条带，黑色背景）
*注1 其具体问题有二：一是背景较高，二是没有条带。
形成机制：条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色，周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则是原因3的现象。在暗室观察是否条带周围有荧光而条带处为暗。如是，则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片。否则一旦耗竭底物，通过减少压片时间，不能解决问题。也可以过一段时间HRP稍减后，重新加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，其原因和上所述相同，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带。
三、显影后膜上条带处变为黄色
*注2 其主要问题显影后膜上条带处变为黄色。
主要原因是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄。压出的X光片可能是正常的，或和原因1或原因3的现象同时存在，仅是一种表面现象，在压过的膜可以看出来。（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1-2min就可以看出来，所以要把握时机。）如果没有达到原因1和原因3的程度，那么一定能够看到很强的荧光，是一种良好的实验结果。如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象，可以不予处理。如果因为荧光太强极易导致条带增粗变大，那么也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s-30s，甚至3-5s，根据结果在暗室进行调整。但也可能由于HRP浓度，无论怎么减少压片时间，条带都依然粗大；那么如果想获得漂亮条带，则必须通过降低抗体浓度来解决。原因1和3，如出现这样的情况，解决方法也是一样的。
二、信号弱或无现象
*注3 这是与1类似，但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，需要特别注意。在HRP极高的情况下，来不及压片就底物已耗竭，往往伴有原因2的现象。可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧光确定，也可以根据原因2的现象确定，以区分于原因4、5、6。除非动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦底物耗竭，通过减少压片时间不能解决问题。也可待HRP稍减后，用TBST简单洗膜重新加底物压片。这种情况下，一抗、二抗稀释10倍以上，依然荧光明显。
*注4 提高抗体上样量以及下述的使用敏感底物/延长压片时间比较简单，在此不赘述。随抗体浓度增高，背景和非特异性可能会增加。一般而言，上样量的极限：对于裂解的混合蛋白，上样孔底面积（平方毫米）* 30ug = 极限上样量；而对于同一分子量的所有蛋白或仅做单一蛋白，则以0.3ug/平方毫米底面积作为极限上样量（见《抗体技术实验指南》的免疫印迹一章）。超过此量可能会导致条带变形。条带信号弱，可通过加大上样量、提高抗体浓度、使用敏感底物、延长压片时间解决。但因为这个极限上样量是确保所有分子量的条带都整齐的极限，而上样超量的表现是，随量的加大，变形的条带由低分子量逐渐往高分子量延伸。所以western极限上样量的真正操作标准是以目的条带不变形作为极限，比如对于150kd的蛋白，完全可以超出一般极限上样量的2倍而不变形（此时，中低分子量条带早已融合或挤为棒槌形了）。
*注6 测试HRP或底物活性：于暗室EP管加底物A、B液各500ul，加入1ul HRP偶联二抗，若底物立即发出蓝光并于随后数分钟内消失说明HRP和底物尚好。
*注7 高背景原因是HRP偶联二抗结合到膜上，其原因包括直接结合、通过膜上蛋白间接结合、通过一抗（主要指多抗中的杂抗体）间接结合、通过封闭物（与封闭物交叉反应）间接结合、洗脱不彻底等。在稀释抗体降低背景的同时，会降低对目的蛋白的结合效率，即以牺牲信号强度为代价。不过，还有一种与稀释抗体恰相反的做法——提高抗体浓度。这种办法适用于HRP结合到膜上较多而且底物相对极其敏感的情况。无论如何稀释抗体和加强洗膜都不能消除背景，或者条带和背景随稀释呈等比例递减甚至条带递减速度比背景还快，如果稀释抗体，则压片时间需延长而背景反而因此更加明显。这种情况下，需要提高抗体含量以提高条带显示程度，而背景随抗体浓度提高并不加强的很厉害。这样则可以通过减少压片时间而达到突出条带降低背景的目的。
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