外泌体简介
      外泌体，英文名：exosome，是细胞分泌的大小为30-100nm的微小囊泡，具有脂质双层膜结构，广泛存在于所有体液中，包括唾液、血液、尿液和母乳等。研究发现，外泌体包含多种活性分子，如蛋白质、脂肪和核酸（mRNA、miRNA及其它非编码RNA）等，能作为信号分子传递给靶细胞，从而介导细胞间的物质传递与信息交流。1983年Johostone等首次发现外泌体的存在，早期这种小囊泡被认为是一种细胞废弃物，有关其研究进展缓慢。然而近年来，外泌体已成为科研热点，其在临床上巨大的应用价值，引起了众多研究者以及商业人士的浓厚兴趣。随着相关技术的发展，有关外泌体在临床的诊断、预后及治疗中的应用研究正在蓬勃开展。 

 

目前，常见的外泌体分离方法有超速离心法、免疫磁珠法、qEV法及外泌体分离试剂盒等方法。

超速离心法

用于从生物体液和培养基分离外泌体，是使用最广泛的方法。利用多次差数离心，去除细胞、大囊泡和碎片，使外泌体得到沉淀。但该方法耗时长，一般需要8-30h，一次仅能处理6个样品，且产率较低，不适用于如血浆和血清等粘性生物液体。

 

免疫磁珠法

外泌体相关抗原的抗体（如CD63、CD9、Alix）可以用作分离外泌体的特异性标记，用包被此类物质的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，达到外泌体吸附分离的目的。该方法可保证外泌体形态的完整性，且特异性高、操作简单，但非中性pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，不利于下一步实验，且不适合大量样本。

qEV法

qEV是利用Size Exclusion Chromatography(SEC)的原理对外泌体进行分离纯化的分离柱。该方法能有效去除样品中杂质蛋白和脂类，且不损伤外泌体活性。与前两种方法比，该方法可得到高纯度外泌体，且快速简单，成本低廉。适合于细胞上清、血液、尿液等体液的外泌体分离。该分离方法常与qNano测量方法联合使用 ，q Nano可利用“可控电阻脉冲传感技术”对外泌体的浓度和尺寸进行快速准确的测量，因此qEV+qNano被视为快速准确的分离和测定外泌体的最佳解决方案。

外泌体分离试剂盒

 

随着外泌体在临床领域的快速发展，市场上出现了有效提取外泌体的产品。外泌体分离试剂盒操作简单、快速、回收率高，且适用性强，可得到高纯度和高完整性的外泌体。

临床应用

目前，外泌体在癌症的诊断、治疗及预后中的应用已成为研究热点，其在生物标记物、肿瘤转移、药物载体和靶点、免疫、心脑血管、损伤修复等多个领域取得了突破性进展。 

生物标记物（肿瘤、胎儿性别）

2015年，美国德州大学安德森癌症中心发表在《 Nature》的研究发现，胰腺癌患者 （包括早期患者）血清中CPC1（glypican-1）阳性的外泌体比例显著高于正常人群。此类外泌体作为潜在的胰腺癌生物标记物，为胰腺癌早期诊断的发展带来了曙光。此外，关于癌症的特异性外泌体的报道也略见不鲜。如，miR-21，-141等八种miRNA被确定为卵巢癌的特异标记；血清外泌体的miRNA，miR-141和miR-375的水平升高与前列腺癌的恶化相关；外泌体miRNA-21，-1246可作为食管鳞状细胞癌（ESCC）特异性标志物；miRN-17等在肺癌病人的血清和肿瘤样品中增加；外泌体miR-19已被证明下调 PTEN，一种肿瘤抑制，并促成脑转移。

外泌体中大量癌症生物标记物的发现，为液体活检注入了强劲的动力。Exosome Diagnostic公司已推出基于尿液外泌体，对前列腺癌进行活检的试剂盒ExoDx(In telliScore)，以及分析血液中外泌体RNA，从而检测肺癌的活检试剂盒ExoDx Lung（ALH）。

除了癌症诊断外，研究发现羊水中分离的外泌体中存在编码ZFY(人类Y染色体的性别决定区，编码一种锌指蛋白)的mRNA，说明外泌体在新生儿诊断中具有应用潜力。此外，有研究发现羊水中外泌体miRNA与怀孕周期相关。

【原文】Melo S A, Luecke L B, Kahlert C, et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer[J]. Nature, 2015.

肿瘤转移

当前，肿瘤转移已成为癌症治疗过程中最大的障碍，抑制肿瘤细胞的转移迫在眉睫 。康奈尔大学Dav id Lyden教授是肿瘤转移研究领域的专家。近期，其团队发现肿瘤细胞在转移前会产生外泌体，该外泌体按照预期进入转移的器官中，可改变这些靶细胞的状态，营造一个适宜肿瘤生长的微环境。这一过程中，外泌体表面的整合素种类决定着靶器官的特异性，例如整合素α6β4和α6β1与肺转有关，而整合素αvβ5与肝转有关。该研究填补了肿瘤转移机制的研究空缺，为后续研究提供了新的思路。

【原文】Hoshino A, Costa-Silva B, Shen T L, et al. Tumour   exosome integrins determine organotropic metastasis[J].N-ature, 2015, 527: 329-335.

药物载体和靶点

药物载体：研究发现，外泌体可通过膜修饰增强细胞特异性靶向作用，为药物治疗提供了良好的载体。加载了β分泌酶 (beta-secretase 1，BACE1)siRNA 的外泌体可穿过血脑屏障，将大脑神经元、小胶质细胞和少突细胞中BACE1 的 mRNA 及蛋白表达下调 60% 左右。

药物靶点：外泌体因其脂质双层膜结构，能很好的保护其包被的物质，且能靶向特定细胞或组织，因此可作为一种潜在的药物靶点。研究发现，肿瘤转移细胞携带大量外泌体miRNA-122，该外泌体可影响靶细胞对葡萄糖摄取能力，为肿瘤细胞提供了高葡糖环境，从而维持肿瘤细胞高水平的糖摄取。此研究结果表明外泌体miR-122可能作为潜在的药物靶点。

【原文】Alvarez-Erviti L, Seow Y, Yin H, et al. Delivery of  siRNA to  the  mouse brain by systemic injection of targeted   exosomes[J]. Nature Biotechnology, 2011, 29(4): 341-345.

【原文】Fong MY, Zhou WY, Liu L, et al. Breast-cancer-secreted miR-122 reprograms glucose metabolism in pre-metastatic niche to promote metastasis [J]. Nature  Ce-ll Biology , 2015,17: 183-194.

 免 疫 

骨髓来源的抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor  cells，MDSCs）是树突状细胞（dendritic cells，DC s）、 巨噬细胞和（或）粒细胞的前体，是骨髓来源的一群异质性细胞，具有显著抑制免疫细胞应答的能力。在长有肿瘤的小鼠和人体内这类细胞增多，并促进了肿瘤的生长。法国国家健康与医学研究院的研究发现小鼠外泌体上的HSP72通过激活STAT3抑制了MDSCs的免疫抑制作用。另外，肿瘤来源的可溶性分子通过Erk激发了MDSCs的扩增。外泌体HSP72通过TLR2/MyD88依赖的方式诱导IL-6的自分泌，从而激活STAT3。更重要的是 ，在3个不同的小鼠肿瘤模型中使用dimethyl amilorid抑制外泌体的分泌可增强化疗药物 cyclophosphamide的抗肿瘤效果。人肿瘤细胞系来源的外泌体可激活MDSCs，从而激发其Hsp72/TLR2依赖的免疫抑制作用。用am-iloride（一种高血压治疗药物，也可以抑制外泌体的形成）处理肿瘤病人来源的MDSCs可降低其免疫抑制作用。该研究发现肿瘤来源的外泌体含有膜蛋白HSP72，促进MDSCs的免疫抑制功能，抑制了肿瘤的免疫监督。

【原文】Chalmin F, Ladoire S, Mignot G, et al. Membrane-associated Hsp72 from tumor-derived exosomes mediates   STAT3-dependent immunosuppressive function of  mou-se and  human myeloid-derived suppressor cells [J].   Journal of Clinical In-vestigation, 2010, 120: 457-471.

心脑血管

内源性血浆外泌体可以传送信号到心脏并提供保护作用，防止缺血再灌注损伤。Vicencio等人研究发现大鼠中外泌体会显著降低心梗梗死面积，外泌体是通过其膜表面上的热休克蛋白HSP70结合到受体细胞膜表面的toll样受体4（TLR4）上，从而介导了心脏保护的功能。心肌梗死或局部缺血后HSP水平升高。其下游机制是通过ERK1/2磷酸化激活p38MAPK，最后使另一种热休克蛋白HSP27磷酸化。抗体中和HSP70可抑制心脏保护作用和ERK1/2和p38MAPK的磷酸化。该研究为外泌体在心梗治疗方面提供了依据。

【原文】Vicencio JM, Yellon DM, Sivaraman V, et al. Plas-ma exosomes protect the myocardium from ischemia-reperfusion  injury[J].Journal of the American College of   Cardiology,2015,65:1525-1536. 

损伤修复

据报道，放疗会抑制骨髓中各种造血细胞的生长繁殖，导致外周血象下降。布朗大学的科研人员发现，间充质干细胞（MSCs）的外膜泡（MSC-EVs）可适度减轻放射损伤。该研究用MSC-EVs处理辐射4h至7天的骨髓干细胞，发现经过处理的损伤细胞在3周到9个月得到显著恢复。此外，注射MSC-EVs可使鼠外周血和骨髓的移植得到部分恢复，且缓解鼠造血细胞系FDC-P1的生长抑制、DNA损伤和细胞凋亡程度，同时刺激正常小鼠骨髓干细胞/祖细胞增殖。该项研究表明，MSC-EVs可以缓解骨髓干细胞受到的辐射损伤。

【原文】Wen S, Dooner M, Cheng Y., et al. Mesenchymal  stromal  cell derived extracellular vesicles rescue radiation   damage to murine marrow hematopoietic cells[J]. Leukemia, doi: 10.1038/leu.2016.107.