大家好，我是红领巾。下面我要讲述的是一个没有小三的故事，一个只有两个蛋白的爱情。

首先简要介绍一下 GST pull-down 技术，高大上的说法是通过已经标记的 GST标签蛋白，从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白，用以确定已知蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系。

通俗地讲就是 GST 标签的 A 蛋白（GST-A）与另一标签的 B 蛋白（作者君用的是 His 标签纯化的体外蛋白 His-B）是否相爱的故事。从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白，作者君称之为一群人的爱情（n>=3），在此就不做解释了。

下面的 protocol 是作者君自己的实验总结，是会写在科研记录薄里存档保存的。不要问我为什么这么无私奉献，因为，我曾是光荣的红领巾。

GST-A 蛋白的 beads 制备

Day 1

1. 把 GST-A（pGEX 载体）质粒转化到感受态细胞 BL21（DE3）中。

转化 protocol：冰上放置 30 min，42℃ 热激 45s，冰上放置 2 min。

2. 加入适量 LB 无 Kana 液体培养基摇菌 1 h，37 ℃，220 rpm/min。

3. 把菌液转移到摇菌管中，5 ml LB+Kana，37 ℃，220 rpm/min 小摇过夜。

Day 2

4. 把 5 ml 小摇过夜的菌液转移到 150 ml LB+Kana 培养基中，继续 37 ℃，220 rpm/min 摇菌 4～5 h。

5. 加入 IPTG 使其终浓度为 0.5 mM，低温诱导 4～5 h（作者君一般设置为 22 ℃）。

6. 5 000 rpm/min，离心 10 min 收菌体沉淀 -80 ℃ 保存。

Day 3

7. 用 10 ml GST Extraction buffer 重悬菌体沉淀，涡旋震荡混匀（具体用多少重悬视菌体沉淀量而定）。

8. 超声处理样品。（注意：一定要在冰上进行，此步非常重要。超声探头使用前请用酒精擦洗并用 ddH2O 擦洗。探头放在液面中间，不碰壁，不触底。仪器设置为 5 s 工作，15 s 休息，防止产热过量）。

9. 15 000 rpm/min，4 ℃，离心 30 min。

10. 每个样品 100ul Glutathione Sepharose（GST beads，用量自定），冰 PBS 洗 2 遍，GST Extraction buffer 洗一遍，每次 500 g/min，离心 5 min，4 ℃。

11. 转移离心后的菌液上清到 Glutathione Sepharose 中，4℃ 转动孵育 1 h。

12. 500 g/min，5 min，4 ℃，去上清。用 GST WashⅠ洗 3 遍（至少用 5 倍 beads 体积的溶液去洗。每次 500 g/min，4 ℃ 离心 5 min）。

13. 用 GST Extraction buffer 洗 5 遍（至少用 5 倍 beads 体积的溶液去洗。每次 500 g/min，4 ℃ 离心 5 min）。

14. 用 GST Wash Ⅱ 洗 2 遍（至少用 5 倍 beads 体积的溶液去洗。每次 500 g/min，4 ℃ 离心 5 min）。

15. 纯化好的带有 GST-A 蛋白的 GST beads 保存在 GST Wash Ⅱ中，4 ℃ 保存（这是由 GST beads 特性决定的，请尽早使用）。

His-B 蛋白的纯化

菌体沉淀制备过程类似于 GST-A，8 000 rpm/min，离心 2 min 收沉淀。具体纯化过程因为篇幅所限就不在此讲述了。

当然，也可以用细胞裂解液来做 pull-down，那么这就不能算是纯粹的体外验证蛋白与蛋白相互作用的实验了，再此不多做讲述。

GST pull-down

千呼万唤始出来，终于要见证两个蛋白的相爱了，好激动！

1. 纯化好的 GAT-A beads 在使用前用冰 PBS 洗 3 遍，每遍 500 g/min，4 ℃ 离心 5 min。

2. 加入适量的 His-B 纯化蛋白（作者君认为 10ug 的量做 pull-down 已经足够了），binding buffer 是 PBS。

3. 4 ℃ 转动孵育 1 h。

4. 洗去非特异性结合：作者君一般是用 GST Wash Ⅱ buffer 洗 5～10 遍，具体次数看两者的结合强弱，需要自己摸索。（当然有 protocol 介绍是用 PBS 去洗，每次离心之前在 4 ℃ 转动孵育 5～10 min，这样清洗效果相对较弱，具体怎么洗看自己喽）。

5. 清洗结束后就可以加 loading 去煮蛋白跑 WB 了。

不过如果你需要跑出来更漂亮的 WB 条带，可以把 pull-down 后的样品用 GST 洗脱液（购自生工，觉得买一瓶后用一辈子也用不完）把蛋白洗脱下来：在 pull-down 样品中加入 100 ul GST 洗脱液（用量自定），4 ℃ 转动孵育 30 min，500 g/min，4 ℃ 离心 5 min，上清就是您想要的 pull-down 样品。

至此，您可以去准备跑 WB 见证这两个蛋白的爱情结晶了。

附：

GST Extraction buffer：

20 mM HEPES（pH7.6），0.5 M NaCl， 0.5 uM EDTA，10% Glycerol，0.5% NP-40

GST WashⅠ：

20 mMHEPES（pH7.6），1 M NaCl， 0.5 uM EDTA，10% Glycerol，1% NP-40

GST Wash Ⅱ：

20 mM HEPES（pH7.6），0.1 M KCl， 0.1 uM EDTA，10% Glycerol，0.02% NP-40

各 buffer 新鲜加入：

1 mM DTT，0.25 mM PMSF，2 ug/ml Apro，1 mM BENZ

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