首先是 mCap，这是业内的第一款帽子类似物，1982 年就已经被用于共转录反应，掺入到 RNA 的 5' 端，使 RNA 具备 Cap0 的结构，可以起始翻译。但是因为 mCap 还能反向掺入到 RNA 的 5' 端，这个正、反掺入的比例，根据数据分析，大约是 5:4，因此用 mCap 作为帽类似物生产的 mRNA，其中有很大部分的 RNA 是没有翻译作用的。

第二个是 ARCA，因为图上标出的氧甲基的修饰，使得其只能以一个方向，正确地掺入到 mRNA 中；对于 mCap，获得的共转录的产物中，获得具有翻译能力的 mRNA 的占比更高；通常 ARCA 需要使用相当于 GTP 4 倍的量，可以获得约 80% 的加帽率。

第三个是 GAG，1984 年即被化学合成，2009 年它首次被用于共转录反应，以获得高加帽率的 mRNA，然后再到新冠爆发，被全球各家公司广泛用于新冠 mRNA 疫苗的生产。相对于二核苷酸加帽类似物，它的优势是：mRNA 制成工艺简单、产量高，加帽效率也高、可以轻松到达 99%；同时可以直接获得 Cap1 的结构，成为现在业内最为广泛使用的帽子类似物。

回顾整个帽子类似物的演变历史，从第一款帽类似物的推出，至今已有 40 年的时间，帽子类似物产品也经历了 40 年的发展。现今，在有 GAG 如此优异的帽子类似物产品的情况下，下一代帽类似物的突破点在哪里？

通常外来物质才会引起免疫反应，关于宿主细胞是如何区分自我和外来的 mRNA，有三篇经典的文献：

①Züst, R., Cervantes-Barragan, L., Habjan, M. et al. Ribose 2′-O-methylation provides a molecular signature for the distinction of self and non-self mRNA dependent on the RNA sensor Mda5. Nat Immunol 12, 137–143 (2011). https://doi.org/10.1038/ni.1979

②Habjan M, Hubel P, Lacerda L, Benda C, Holze C, Eberl CH, Mann A, Kindler E, Gil-Cruz C, Ziebuhr J, Thiel V, Pichlmair A. Sequestration by IFIT1 impairs translation of 2'O-unmethylated capped RNA. PLoS Pathog. 2013;9(10):e1003663. doi: 10.1371/journal.ppat.1003663. Epub 2013 Oct 3. PMID: 24098121; PMCID: PMC3789756.

③Devarkar, Swapnil C., Wang, Chen, Miller, Matthew T., Ramanathan, Anand, Jiang, Fuguo, Khan, Abdul G., Patel, Smita S., and Marcotrigiano, Joseph. Structural basis for m7G recognition and 2'-O-methyl discrimination in capped RNAs by the innate immune receptor RIG-I. United States: N. p., 2016. Web. doi:10.1073/pnas.1515152113.

RLR 信号通路

通过三篇文献的研究，我们发现高等生物细胞内 MAD5 和 RIGI 的两条通路，它们结合病毒 RNA 就能促发信号通路产生 I 类干扰素和促炎因子；而 I 类干扰素可以诱导 IFITs 蛋白大量产生，使其结合 mRNA 的 5' 端帽子结构，抑制 mRNA 的反应。甲氧基修饰 mRNA 即 Cap1 的结构的作用有两点：一是阻止或减弱触发 MAD5 和 RIGI 的通路，二是逃脱 IFITs 的识别。

既然，2'-O-methyl 修饰（即 Cap1 结构）是宿主区分自我和非自我RNA的关键，那么对于逃脱宿主的初始免疫反应，Cap1 结构是否已经足够好？

此处介绍另外一篇重要文献：Abbas YM, Laudenbach BT, Martínez-Montero S, Cencic R, Habjan M, Pichlmair A, Damha MJ, Pelletier J, Nagar B. Structure of human IFIT1 with capped RNA reveals adaptable mRNA binding and mechanisms for sensing N1 and N2 ribose 2'-O methylations. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Mar 14;114(11):E2106-E2115. doi: 10.1073/pnas.1612444114. Epub 2017 Mar 1. PMID: 28251928; PMCID: PMC5358387.

这篇文献提到：（1）酵母细胞内过表达人源的 IFIT1，可以结合 Cap0 和 Cap1 结构的 mRNA；（2）仅 N1 甲基（即 Cap1）可能不足于保护所有内源 mRNA 不被 IFIT1 结合，可能 mRNA 分子中还存在其它区分自我和非自我的结构；（3）N2 甲基（即Cap2）可以充当第二角色，提供额外的保护。

我们再仔细分析 mRNA 和 RIGI，mRNA 和 IFIT1 结合的 3D 结构。在 mRNA 和这两个蛋白的结合口袋中，已发现氧甲基修饰起到的是空间位阻的作用，而降低结合效率。

设想如果不是甲氧基，而是一个更大的基团，如乙基或 MOE，是不是会有更好的效果。下图是兆维申请的专利结构。

兆维新帽子类似物结构

通过合成大量不同结构的帽子，体内外实验筛选，我们现在推出这两款帽子结构。我们可以称新帽子为乙基帽子，图中红色圈出了原本是甲基的位置，现在被乙基取代。乙基帽子使用方式，转录条件和相对应的甲基帽子相同，转录产量也相当；加帽效率在根据反应条件、序列不同，在 94~99% 之间。让我们来看看乙基帽子的翻译效果。

In vivo Lipopolysaccharide simulation model Luminescence imaging in mice

实验制备的 Fluc mRNA 是含有添加碱基 U 或 N1 甲基假尿苷修饰，3 个新旧帽子，共 6 个组合的 mRNA。注射小鼠 6 小时后，活体成像获得小鼠全身平均荧光值；然后解剖小鼠，去除脏器，再获得部分肺、肝、脾、淋巴的荧光值。

在 PBS 组，无论是 1μg 还是 10μg 的 mRNA 注射量小鼠全身的荧光通量基本相当，1μg 是超过 1010；10μg 超过 1011。新旧帽子的翻译没有区别；普通 U 和 N1 甲基假尿苷的 mRNA，也没有什么区别；但是看脾脏，图中划了虚线的部分，大家可以发现，脾脏中的荧光值，修饰碱基的翻译好于天然碱基；乙基帽子好于甲基帽子。而且，碱基修饰的翻译优势和乙基帽子的翻译优势在高剂量组内可以叠加。

再看左边的 LPS 组；相对于右边的 PBS 组，大家可以发现天然碱基 U 的，甲基帽子的 mRNA 翻译效果大幅下降，这个就是 LPS 引发的促炎因子造成的抑制翻译的结果。而修饰碱基或乙基帽子大幅改善翻译，并且碱基修饰和乙基帽子的改善效果可以叠加。从图中可以看到，有 10 倍翻译量的提高；脾脏的情况也是如此。

再看反复注射的小鼠体内实验。

Multiple Injections in vivo

这个实验是间隔三天注射一次 Fluc，然后体外成像。甲基帽子在第二针其翻译效果就是第一针的 1/10；而乙基帽子可以基本维持不变。反复注射的 mRNA，脂质体和天然碱基 U 会激发天然免疫，新帽子克服天然免疫对 mRNA 翻译的抑制，具有更佳、更平稳的翻译效果。

这些研究结构证明了上海兆维理性设计了新的帽子结构在体内外实验证明新帽子大幅改善 mRNA 在免疫压力条件下的翻译。相比较于灵长类，小鼠对于促炎因子的耐受范围更广，因此，新帽子 mRNA 在灵长类上会有更佳翻译效果，更为线性的剂量-药效关系。