急性骨髓性白血病 AML 是造血干细胞（HSC）和原始祖细胞的一种侵袭性克隆疾病，它们的髓系分化会受阻，生成自我更新的白血病干细胞（LSC）。2019 年 4 月 25 日，来自英国爱丁堡大学的 Kranc 等人发现 m6A 阅读蛋白 YTHDF2 在 AML 患者身上广泛过表达，在小鼠和人类 AML 发生和发展过程中起着关键的作用。
YTHDF2 降低可抑制白血病
研究者首先检测了 YTHDF2 在不同细胞遗传型的 AML 患者骨髓样品的表达情况，发现 YTHDF2 普遍升高，特别是在原代 AML 样本中。研究者在已发表数据中发现 YTHDF2 的表达与白血病干细胞活性有关，提示 YTHDF2 有可能促进了疾病的进程。
YTHDF2 在不同的 AML 亚型中均上调了，是 AML 发展所必需的。
研究者通过小鼠模型实验发现降低 YTHDF2 可以显著抑制白血病进程，延长荷瘤小鼠的生存时间；利用构建的白血病干细胞和 AML 细胞，研究者进一步证实随着细胞内的 YTHDF2 减少，AML 的发展会受到抑制。值得注意的是，YTHDF2 的缺失会增强造血干细胞的活性，促进造血干细胞的扩增，但是并没有影响造血干细胞的正常功能。
造血干细胞在敲除了 Ythdf2 之后，整体上长期的重建能力与对照组无显著差别，而骨髓谱系重建的潜力增强了，B 细胞重建能力正常，T 细胞重建能力减弱。
YTHDF2 降低 m6A RNA 稳定性
YTHDF2 是如何参与白血病进程的呢？研究者敲除了白血病前期细胞的 YTHDF2，导致 754 个基因表达上调，528 个基因表达下调。通过 meRIP-seq，研究者发现敲除组中显著上调的 mRNA 具有丰富的 m6A 修饰。
利用 meRIP-seq 分析 Ythdf2 敲除组和对照组的转录组 m6A 甲基化修饰图谱。B, Ythdf2 敲除后 mRNA 表达减少、不变和增加的 3 个分组的 m6A 峰的错误发现率 FDR。C, Violin 图显示敲除组和对照组的表达变化，分了无 m6A 修饰、有 m6A 修饰和丰富 m6A 修饰的 3 个组做对比。D, 敲除组和对照组 mRNA 表达变化的累积分布曲线，敲除组有 m6A 修饰的 mRNA 表达上升。
研究者猜测，在 YTHDF2 敲除组中带有 m6A 修饰的 mRNA 的上调，有可能是因为半衰期增长。因此研究人员利用 SLAM-seq （即 thiol (SH)-linkedalkylation for the metabolic sequencing）检测 mRNA 的半衰期，证实了这个猜想。
利用 SLAM-seq 分析 Ythdf2 敲除组和对照组的转录组半衰期。E，衰减曲线显示敲降组的 mRNA 半衰期稍微增长。F，累计分布曲线，在对照组中，有 m6A 修饰的 mRNA 比没有 m6A 修饰半衰期整体缩短；G，YTHDF2 的缺失，使含 m6A 修饰 mRNA 半衰期进一步增长。
随后，研究者利用 RIBO-seq 检测两个组的蛋白翻译效率，发现 YTHDF2 的缺失后，无论是有 m6A 修饰的还是没有 m6A 的 mRNA，翻译效率都没有显著改变。这些结果表明 YTHDF2 在白血病中促进 m6A mRNA 的降解，而这个降解受 m6A 的指导。
利用 RIBO-seq 分析 Ythdf2 敲除组和对照组的翻译效率。H, 火山图显示两组的翻译效率变化。I, 两组 mRNA，m6A 高水平、m6A 低水平和无 m6A 修饰的 mRNA 分别的累计分布曲线。
YTHDF2抑制TNF信号通路
为了进一步了解上调的 mRNA 甲基化背后的分子机制，研究者进行了 CPDB 互作网络分析，发现在 Ythdf2 敲降组中有着高 m6A 水平的基因与 TNF 信号通路、线粒体功能等相关。
进一步分析发现 TNF 介导的细胞凋亡通路在白血病中被抑制，其中 TNFR2（Tnfrsf2）是 YTHDF2 的靶基因。YTHDF2 结合并促进它的降解，从而抑制 TNF 信号通路。YTHDF2 的缺失使得白血病细胞对 TNF 更加敏感，这有望成为提高 TNF 治疗效果的新策略。
YTHDF2 缩短了多种 m6A 转录本的半衰期，提高白血病干细胞功能的整体完整性，包括肿瘤坏死因子受体 Tnfrsf2。Tnfrsf2 在缺失了 Ythdf2 的白血病干细胞质粒细胞中上调。因此，研究者认为可以通过抑制 YTHDF2，靶向白血病干细胞，成为一个新的治疗手段。
Epi 老师：
这篇文章的研究思路清晰，运用的主要研究技术也比较典型，所以我把研究路径整理归纳如下图，大家可以把这篇文章收藏起来，认真阅读。
关于 meRIP-seq
最新研究发现，m6A 修饰在调控基因表达、剪接、RNA 编辑、RNA 稳定性、控制 mRNA 寿命和降解、介导环状 RNA 翻译等方面扮演重要角色。因此 meRIP-seq 助力解决细胞分化，生物发育、疾病发生发展，热休克反应等生物学问题。利用最新的去 rRNA 技术，可以同时检测 mRNA, lncRNA 及环状 RNA 的甲基化修饰谱，帮助研究人员对 RNA 转录后甲基化修饰图谱进行全面研究，是表观转录组学研究的关键技术。
关于 SLAM-seq
SLAM-seq，即 Thiol(SH)–linked alkylation for the metabolic sequencing of RNA，可以理解为「4sU 烷基化 RNA 代谢测序」：向合成中的 mRNA 链中掺入 4-thiouridine (4sU)，使原本的碱基T被4sU修饰，从而在反转录中被错认为 C，导致原本应该为碱基A的位置错配成为 G。通过测序分析这些错配的 G，就可以对新合成 mRNA 进行直接的定量，是检测 RNA 对各种干扰产生的应答的一种简单、稳定、可量化的技术，可用于探索细胞调控机制。
关于 Ribo-seq
Ribo-seq (Ribosome profiling)，即核糖体印迹测序技术，系由 Weissman 课题组于 2009 年首次发表的翻译组学研究技术。利用 Ribo-seq，研究者能从基因组水平检测蛋白质的翻译状况，获得全面的、高质量的蛋白质翻译速度情况，了解蛋白质表达情况及其丰度；还能直接对翻译过程进行研究。
原文：Paris J, Morgan M, Campos J, et al. Targeting the RNA m6A Reader YTHDF2 Selectively Compromises Cancer Stem Cells in AcuteMyeloid Leukemia. Cell Stem Cell. 2019 Jul 3;25(1):137-148.e6.
评论