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病毒分离纯化挑战与突破

2020-12-21 10:43

目前新型冠状病毒肺炎疫情在国内已导致超 8 万人感染,2700 多人失去生命。这让全世界感到恐慌的疫情主要是由新型冠状病毒所引起的,即使是科学技术高度发达的今天,我们对这种新型病毒的了解及应对方法也是非常有限的。

要对新型冠状病毒进行详细研究,首要的任务是病毒的分离。本文将从以下方面简单地介绍一下病毒及类病毒的分离纯化技术发展状况。


图片来自纳微科技

1. 综述

层析分离技术原理是根据混合样品分子尺寸、电荷、疏水等物理性能差异,让不同组分有序流出以达到分离的目的。而层析分离效果主要取决于层析柱中的层析介质微球,由于制备技术牵涉到材料、生物、化学等交叉技术领域,且技术门槛高,所以目前国内大多数产品基本依赖进口。

2. 层析介质材料种类及其对生物分离性能的影响


图片来自纳微科技

目前市场上用于生物分离层析介质的材料主要由两大类组成:第一类是以琼脂糖、葡聚糖为代表的天然高分子层析介质,第二类是以聚苯乙烯和聚丙烯酸酯为代表的合成高分子层析介质。

3. 层析介质粒径大小及均匀性对生物分离的影响


单分散与多分散层析介质分离性能对比示意图
图片来自纳微科技

层析介质粒径和分布是影响其分离性能最重要的参数。粒径越小,分布越均匀,应用到层析柱的柱效和分辨率也会提高。纳微科技成功开发出单分散大孔聚合物层析介质,成功填补了国内这一领域的空白,为行业发展做出了贡献。

4. 介质孔径大小及孔隙率对生物分离的影响

孔径、比表面积及孔隙率也会影响介质生物分离纯化。对于病毒这种大尺寸的生物体,需要 400 纳米以上超大孔的介质。但超大孔径介质制备技术难度极大,这也是目前没有合适的层析介质可以有效分离病毒的原因。


不同孔径大小的单分散聚合物色谱填料图
图片来自纳微科技

5. 层析介质功能基团对生物分离性能的影响

功能基团的物化性能决定了生物分离模式、选择性和载量,因此选择合适功能配基尤其重要。另外配基与基球表面距离也会影响其介质的分离性能。


制备各种层析介质化学反应示意图
图片来自纳微科技

6. 病毒分离纯化的挑战与解决方案

病毒尺寸在 20-100 纳米之间,为满足病毒高效分离纯化的需求,纳微开发出三种病毒分离纯化介质及解决方案,分别为超大孔单分散聚合物层析介质用于病毒分离纯化;小粒径无孔层析介质分离纯化病毒;孔径均一的整体柱分离纯化病毒。

6.1 超大孔单分散聚合物层析介质用于病毒分离纯化

超大孔单分散层析介质粒径均匀,孔径大(>400 纳米),使得静态吸附载量大幅度提升,还可有效降低病毒与填料表面配基之间多位点结合,避免亚基的解聚,使病毒结构更加稳定。另外其容易放大生产,重复性好。但超大孔层析介质制备技术难度大,且其机械强度差,耐压性差,容易破碎,会导致筛板堵塞,压力升高等。

以下为纳微超大孔径 DEAE 离子交换层析介质在流感病毒(H5N2)纯化中的数据,结果显示超大孔介质对流感病毒的分离纯化比传统层析介质具有明显的优势。


纳微超大孔 DEAE 离子交换介质对病毒纯化色谱图
图片来自纳微科技


几种填料对于流感病毒 H5N2 纯化回收率的比较
图片来自纳微科技
(A: 超大孔径(4300Å)DEAE 层析介质; B:传统聚甲基丙烯酸材质 DEAE 介质; C:琼脂糖 DEAE 层析介质)

6.2 小粒径无孔单分散层析介质用于病毒的分离纯化

纳微已开发出世界领先的微球精准制造技术,该技术可以对微球大小,均匀性进行精准控制。且层析柱孔隙大小可控、耐压性好、柱床稳定、柱效高等,可显著提高病毒的纯化效率,大幅度提高病毒纯度。

以纯化溶瘤病毒为例,纯化前 SEC 测试纯度为 6.5%。纯化采用两种基质相同的介质,主要区别是前者是无孔实心的层析介质,而后者是传统的多孔层析介质。从层析图谱可以看出,在洗脱及 CIP 过程中无孔介质洗脱杂质峰值更低,有利于病毒分子纯化。通过分析比较,发现用传统的多孔层析介质实验得到的病毒样品纯度为 54%(图),而用无孔的同类型介质实验得到的病毒纯度达到接近 90%(图)。


常规 1200Å孔径聚苯乙烯材质离子交换纯化溶瘤病毒
图片来自纳微科技


10 微米级别聚苯乙烯实心球纯化溶瘤病毒
图片来自纳微科技


多孔与无孔介质纯化溶瘤病毒效果比较
图片来自纳微科技

6.3 孔径均一的整体柱用于分离纯化病毒

整体柱具有孔径大、机械强度高、压力低、高通量等优点,更有利于病毒及病毒类(疫苗)生物大分子的分离纯化。

纳微与台湾创新材料合作开发出孔径及孔隙率可精确控制的新方法 (Tantti 整体柱)。这种方法是利用单分散聚合物微球为模板填充在整体柱中,然后把单体及交联剂填充到微球的空隙中,加热聚合后,再把模板微球清洗掉留下尺寸与微球模板大小一致的多孔整体柱。整体柱的孔径大小可精确调节,不受反应条件影响,因此,重复性好且容易放大生产。 这种创新的整体柱将极大提升其病毒的分离纯化性能,甚至为病毒、病毒类(疫苗)、腺伴随病毒 (AAV) 等生物大分子的分离纯化带来革命性的影响。


单分散微球模板法(左)与传统方法(右)制备整体柱的孔径结构对比图
图片来自纳微科技


不同孔径 Tantti 整体柱电子显微镜图与孔洞分布图
图片来自纳微科技

Tantti 系列的阴离子整体柱已在流感病毒纯化中取得不错的验证效果,且最大做到 9 cm 直径规模,可满足中试级病毒纯化需求。可以预期,孔径可精确控制且批次重复性好的整体柱一定会成为病毒分离纯化的理想材料。

TanttiMonolith SAX 整体柱应用于流感病毒 H7N9 纯化案例如下:


图片来自纳微科技

除了疫苗病毒、类病毒纯化外,目前 Tantti 整体柱正针对基因细胞疗法中所使用的腺相关 (AAVs)、慢病毒 (Lentivirus) 等进行纯化验证。

总结

层析分离效果很大程度上取决于层析介质材料,层析技术重大进步往往是随着新的材料的出现而发展的。高机械强度超大孔结构微球研究成功将推动传统层析介质在病毒及类病毒(疫苗)分离纯化的广泛应用;单分散无孔层析介质开发成功可以极大提高病毒的纯度;而以单分散微球为模板制备孔径可控的整体柱将变革病毒分离纯化技术。纳微将一如既往引领分离纯化介质的创新,促进病毒高效分离技术的应用。

图片来源:纳微科技

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