印迹
分离蛋白质混合物后，将其转移至膜上。使用垂直于凝胶表面取向的电场进行转移，使蛋白质移出凝胶并移动到膜上。将膜以夹层结构放置在凝胶表面和正电极之间。夹层包括两端的纤维垫（海绵）和滤纸以保护凝胶和印迹膜。这里有两件事非常重要：（1）凝胶和膜的紧密接触以确保清晰的图像和（2）膜在凝胶和正极之间的位置。膜必须如此放置，以使带负电荷的蛋白质从凝胶迁移到膜上。这种类型的转移称为电泳转移，可以在半干或潮湿条件下进行。湿条件通常更可靠，因为它不太可能干燥凝胶，并且对于较大的蛋白质是优选的。
膜，固体支持物，是该过程的重要部分。有两种类型的膜：硝化纤维素和PVDF。硝化纤维素因其对蛋白质及其保留能力的高亲和力而被使用。然而，它是脆的，并且不允许膜用于重新制造。在这方面，PVDF膜提供更好的机械支持并允许重印和储存印迹。然而，PVDF膜的背景更高，因此仔细清洗非常重要。
洗涤，封闭和抗体孵育
阻断是蛋白质印迹的一个非常重要的步骤，因为它可以防止抗体非特异性地与膜结合。通常使用在TBST中稀释的5％BSA或脱脂奶粉来阻断以减少背景。
通常优选脱脂奶粉，因为它便宜且广泛可用。但是，牛奶蛋白质与所有检测标签不兼容，因此必须小心选择合适的封闭溶液。例如，BSA封闭溶液优选具有生物素和AP抗体标记以及抗磷蛋白抗体，因为乳含有酪蛋白，酪蛋白本身是磷蛋白和生物素，因此干扰测定结果。将一抗与BSA一起孵育通常是一种很好的策略，因为它通常需要比二抗更高的量。如果印迹不能提供良好的结果，将其置于BSA溶液中可以重复使用抗体。
抗体的浓度取决于制造商的说明。可以将抗体稀释在洗涤缓冲液中，例如PBS或TBST。洗涤非常重要，因为它使背景最小化并去除未结合的抗体。然而，膜不应该长时间洗涤，因为它也可以减少信号。
然后使用标记抗体检测膜，通常用酶如辣根过氧化物酶（HRP）检测，其通过其产生的对应于靶蛋白位置的信号检测。该信号被捕获在通常在暗室中开发的胶片上。
定量
非常重要的是要注意，通过蛋白质印迹产生的数据通常被认为是半定量的。这是因为它提供了蛋白质水平的相对比较，但不是数量的绝对量度。有两个原因; 首先，在单独的通道中样品之间的加载和转移速率存在差异，这些通道在单独的印迹上是不同的。在进行更精确的比较之前，需要对这些差异进行标准化。其次，通过检测产生的信号在样品的浓度范围内不是线性的。因此，由于产生的信号不是线性的，因此不应用于模拟浓度。
评论