大鼠小脑颗粒/小脑颗粒/小脑颗粒细胞

注册证号 ：详询

英文名 ：大鼠小脑颗粒细胞

CAS号 ：无

库存 ：5x10^5/cell

供应商 ：酶研生物

肿瘤类型 ：详询

细胞类型 ：大鼠小脑颗粒细胞

ATCC Number ：否

品系 ：大鼠小脑颗粒细胞

组织来源 ：大鼠小脑颗粒细胞

相关疾病 ：//

物种来源 ：大鼠小脑颗粒细胞

免疫类型 ：1

细胞形态 ：正常

是否是肿瘤细胞 ：否

器官来源 ：大鼠小脑颗粒细胞

运输方式 ：自取或顺丰快递发货

年限 ：永久

生长状态 ：活力好，原代提取

大鼠小脑颗粒/小脑颗粒/小脑颗粒细胞

FCM数据的存贮的方式是FCS2.0（flow cytometry standard），采用列表排队(List Mode)方式。易于加工处理分析，但缺乏直观性，数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种；由数据还可以做出标准曲线进行定量分析。

Q1：坐标轴的意义？
1、  单参数直方图
每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计分布，以直方图的方式来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数（channel），可以是线形（line）或者对数（log）。纵坐标一般是相对细胞/粒子数（count）！

2、  二维图
在二维图的中，横坐标/纵坐标都表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，可以是线形（line）或者对数（log）。双参数图可以将样品细胞群分开，从而方便对感兴趣的细胞进行分析。

Q2：“Gate”和 “Regin”？
设门是流式细胞分析中一种重要的技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析数据，从而得到临床诊断和科研中有价值的信息。

On-line gating(threshold gating)监测/获取数据
Off-line gating： 分析实验数据          散射光设门/荧光设门          散射光/荧光联合设门         

多重逻辑门(组合门)多重逻辑门 G3=R1 and R2 (G3=R1×R2)

其它： G=R1 or R2 G=R1 not R2Q3:流式图中的颜色与荧光颜色?

流式图中的颜色为区分不同细胞群而人为指定, 与荧光颜色无关!!

Q4：流式图中的阴/阳（N/P）如何划分?
如何做M1阴性界限？实际上，这个M1的划分完全是根据阴性(同型)对照来的！如下图：左图为同型对照，即：您所检测的物质在阴性组中的基础表达量，可以理解为背景、静息状态下、基础水平、未受刺激时等。右图即阳性组，也就是接受刺激后，功能状态下、药物作用后等。
Q5:  这么巧，阴性正好在101划分？？
其实, 我们可以人为地将电压，放大倍数调到相应的大小，使阴性的右边界在某一个值上，（通常划在101附近）这样后期做sample时好看！当然也可以调到102，103次方。

Q6：为什么要进行荧光补偿？
流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。
 

大鼠小脑颗粒/小脑颗粒/小脑颗粒细胞

“荧光补偿”这个术语是指修正荧光渗漏的过程，如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。

MTT法实验步骤

1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。

细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。对于初学者而言，要使细胞达到5-10×104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。

以一般细胞培养常用的25cm2为例，

1)细胞密度在长到约80%~90%(下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态)，消化离心收集后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。

2)另取一支新的15ml无菌离心管(为下一步接种96孔板用)，装入约9ml培养基.

3)从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml, 加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5-10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞(见下图);如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。

4)细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以(相当于细胞悬液密度为2×104/ml)，细胞毒性实验每孔5000—10000个(相当于细胞悬液密度为5×104/ml)。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。

2.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。

注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。

3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否则难以反应真实情况。下图可做为96孔板的的参考步局。

对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉(可以用排枪吸走)再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。

4.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。

5.每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液

6. 终止培养，准备溶解结晶。
 

大鼠小脑颗粒/小脑颗粒/小脑颗粒细胞

溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解

1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。

2) 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

另一种方法，用三联溶解液(见上面MTT甲瓒溶解液)

1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。(该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。)

2) 放入培养箱中继续孵育4—6小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。

在实际的操作过程中，往往为了等待4—6小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测OD值，给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对OD值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。

7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。