Trelief® SoSoo Cloning Kit/克隆系列/无缝克隆技术/擎科生物TSINGKE

【产品简介】
SoSoo重组克隆试剂盒利用同源重组的原理，可快速将1~5个片段定向克降到任意方式线性化的载体中。本试剂盒含有的2×SoSoo Mix可将单个或多个片段定向重组至载体中，克服了酶切位点的限制，产物可直接转化感受态细胞。重组反应可在恒温条件下快速进行（50℃C处理15 min），数小时内即可完成从DNA样品准备到重组产物的转化涂板培养的全部操作。

【产品特点】
快速：反应仅需15 min；
简单：不受片段酶切位点影响，无需对片段进行酶切；
高效：阳性率可达95%以上；
无缝：不引入额外序列。

【产品组成及保存】
-25℃~-15℃保存1年，避免反复冻融。

组分	规格（20 次）
2×SoSoo Mix	100 µL
Control Template（5 ng/µL）*	10 µL
Control Vector（10 ng/µL）**	10 µL

*线性化质粒，抗性为 Amp，含 M13F/R 序列。
**阳性对照片段，大小为1,000 bp。

【产品应用】
无缝克隆；
定点突变；
高通量克隆。

【注意事项】
重叠区域的Tm值尽量一致且>60℃；
线性化载体和片段PCR产物必须凝胶纯化，常用的分光光度法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响，测定值和DNA实际浓度往往偏差较大，推荐纯化后通过琼脂糖凝胶电泳检测其质量和浓度；
控制好载体和片段的用量及摩尔比，线性化载体用量在10~100 ng之间，载体和插入片段摩尔比1∶2~1∶10均可，多片段连接时各片段摩尔比为1∶1。
加样完成后，吹打混匀，低速瞬时离心使所有溶液至离心管底部，重组产物即连即转；
建议每次实验，做阳性片段和阳性质粒的对照。

【操作流程】
按照如下体系配制反应液，混匀瞬时离心后上机。50℃，15 min。

组分	体积
2×SoSoo Mix	5 µL
插入片段 1	X1 µL*
......	......
插入片段 n	Xn µL
线性载体	Y µL *
ddH2O	Up to 10 µL

*载体与插入片段的摩尔比为1：2~1：10。多片段连接时各片段之间摩尔比为1：1。
pmols=（质量ng×1000）/（片段长度bp×650 daltons）。
公式简化后V载体：V片段=摩尔比×（B载体C片段/B片段C载体）
（V表示体积，B表示片段长度，C表示浓度）
例如：
5 kb线性化载体（20 ng/µL）与2 kb的插入片段（100 ng/µL）以摩尔比1：5连接。载体和片段的体积比计算为：
即V载体：V片段=1/5×(5×100/2×20)=2.5，所以反应体系为
 

组分	体积
2×SoSoo Mix	5 µL
插入片段	1.4 µL
线性载体	3.6 µL
ddH2O	Up to 10 µL

【实例分享】
使用Trelief ^TM SoSoo Cloning Kit（TSV-S1），分别将 1 kb、5 kb 的目的片段插入载体 pcDNA3.1（+）中，结果显示插入成功率均为100%。
【问题讨论】
Q1.不长菌落或菌落极少?
1）感受态效率低
使用新制备或妥善冻存的感受态细胞，确保转化效率>107cfu/ ug。每次可设置一组转化质粒的对照实验，以检测感受态细胞的转化效率。
2）线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足或过量，或者比例不佳。
3）PCR产物未纯化或紫外照射时间过长在365nm长波紫外下切胶纯化，短波紫外会损伤DNA。
4）线性载体和插入片段不纯，抑制反应
实验证明连接体系中FDTA，胍盐等会显著降低重组效率，可再次纯化去除盐分的干扰。DNA纯化产物推荐溶解保存在pH8.0的ddH2O中。
5）平板抗生素使用错误或浓度过高核查平板抗性以及浓度是否正确。



本试剂产品仅供科学研究或进一步生产使用,不可用于临床诊断或治疗。