小鼠胰岛细胞/小鼠胰岛细胞/小鼠胰岛细胞

注册证号 ：详询

英文名 ：//

CAS号 ：//

库存 ：5×10⁵Cells/T25培养瓶

供应商 ：上海名劲生物

肿瘤类型 ：详询

细胞类型 ：咨询客服

ATCC Number ：详询

品系 ：//

组织来源 ：小鼠胰岛细胞

相关疾病 ：无

物种来源 ：小鼠

免疫类型 ：无

细胞形态 ：正常

是否是肿瘤细胞 ：详询

器官来源 ：小鼠胰岛细胞

运输方式 ：常温顺丰

年限 ：永久

生长状态 ：良好

规格 ：瓶

小鼠胰岛细胞/小鼠胰岛细胞/小鼠胰岛细胞

实验目的和要求：
掌握无菌操作技术。
了解小鼠解剖操作技术。
了解原代 细胞培养 的一般方法与步骤
了解培养细胞的消化分散。
了解细胞计数方法。
了解倒置显微镜的使用。

实验原理 ：

原代 细胞培养
是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。

实验内容：

动物的选择：
选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。
每组小鼠胚胎1个

实验材料：
每组的超净台中有以下物品：
1. 50ml 配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶
2. 100ml灭菌烧杯2个；
3、50ml离心筒2个
4、灭菌培养皿1个， 细胞培养 瓶1个
4、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个
5、细胞计数板1块；
6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把；
7、酒精灯1台；

试验操作步骤：
1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)
a．采用认可的方案处死啮齿动物。
b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。
c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。
f．漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

2)将1－2个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用PBS漂洗。
3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离心筒中, 加入40ml 0.25％的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。
4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分钟。
5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。

6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。
7)离心混合的细胞悬液，1200r/rain，5分钟，弃上清。
8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。
9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。小鼠胰岛细胞/小鼠胰岛细胞/小鼠胰岛细胞


一、组织块直接培养法

1、取材，用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

2、用手术剪将组织剪切成1mm3 左右的小块，再用Hank's液洗三次。

3、将组织块转移至培养瓶，并贴附于瓶底面。

4、轻轻将培养瓶翻转，瓶底朝上，向瓶内注入适量的培养液，将培养瓶放置在37℃恒温箱内培养。

5、放置待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。

二、消化培养法

1、取材，用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

2、用手术剪将组织剪切成1mm3 左右的小块，再用Hank's液洗三次。

3、视组织块量加入酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

4、加入3—5ml培养液以终止酶消化作用（或加入相关酶抑制剂）。

5、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。

6、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。

7、加入Hank's液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

8、加入培养液1—2ml（视细胞量），血球计数板计数。

9、将细胞转移到培养瓶中，37℃下培养。

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三、 器官培养

1、将不锈网做成支架形状，调整其高度至培养皿的1/2深度平面，在其表面放置0.5μm孔径滤膜。

2、将培养液加入培养皿中，使液面刚刚接触到滤膜，但不要使其浮起。

3、将要培养器官组织放在滤膜上，一般厚度不要超过200μm，水平面积不超过10mm2 。

4、将上述准备好的培养物放入CO2 培养箱，并加注氧气调整氧分压，最好到90%。

5、培养过程中要注意观察培养液平面，尽可能保持在与滤膜一致的水平上。

6、上述可进行器官培养1-3周，每2-3天换液一次，并根据情况做进一步实验和检测。