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文献和实验
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库存 :65
英文名 :Aconitase (ACO) activity detection kit
CAS号 :无
保质期 :1年
供应商 :上海晅科生物科技有限公司
保存条件 :2-8℃
规格 :50管/48样
顺乌头酸酶(ACO)活性检测试剂盒说明书
分光光度法 50 管/48 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义
顺乌头酸酶(aconitase),三羧酸循环中的酶,催化柠檬酸转变为异柠檬酸。柠檬酸本身不易氧化,在顺乌头酸酶作用下,通过脱水与加水反应,使羟基由β碳原子转移到α碳原子上, 生成易于脱氢氧化的异柠檬酸,为进一步的氧化脱羧反应作准备。测定原理
ACO 催化柠檬酸转化成异柠檬酸,异柠檬酸氧化脱羧将 NAD+ 还原生成NADH,导致 340nm处光吸收上升。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。试剂的组成和配制
试剂一:50mL×1 瓶,-20℃保存; 试剂二:10mL×1 瓶,-20℃保存; 试剂三:1mL×1 支,-20℃保存;试剂四:液体 60mL×1 瓶,4℃保存; 试剂五:液体 5mL×1 瓶,4℃保存;
试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存;临用前加 3mL 蒸馏水充分溶解;现配现用试剂七:粉剂×1 支,4°保存;临用前加 36mL 试剂四充分溶解;
工作液:临用前在 36mL 试剂七中加入 3mL 蒸馏水、3mL 试剂四、3mL 试剂五、3mL 试剂六充分混匀
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆转入离心管内 600g,4℃离心 5min。
3、 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。
4、 上清液即胞浆提取物,可用于测定胞质顺乌头酸酶活性。
5、 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或
200W,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),用于线粒体顺乌头酸酶活性测定。
测定步骤
1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。2、 样本测定
(1)将工作液,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min;现配现用;若分次用将工作液分装后于-20°保存,一星期内可用。
(3)在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 样本 900μL 工作液,混匀,立即记录 340nm 处 20s
时的吸光值 A1 和 3min20s 后的吸光值 A2,计算ΔA=A2-A1。
相关图片:
ACO 活性计算
用石英比色皿测定的计算公式如下
- 按样本蛋白浓度计算
ACO 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V 样) ÷T=536×ΔA÷Cpr
- 按样本鲜重计算
ACO(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=108×ΔA÷W
- 按细菌或细胞密度计算
上海晅科生物科技有限公司
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