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文献和实验
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库存 :33
英文名 :α-Galactosidase (α-GAL) Test Kit
CAS号 :无
保质期 :1年
供应商 :上海晅科生物科技有限公司
保存条件 :2-8℃
规格 :100管/48样
α-半乳糖苷酶(α-Galactosidase, α-GAL)试剂盒
微量法 100 管/48 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义:
α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,能专一地催化 α 半乳糖苷键的水解,主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL 对于植物种子的萌发至关重要,种子萌发初期,其催化产生的 D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗,为种子的萌发提供最初的能量来源,后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。测定原理:α-GAL 分解对-硝基ben-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基ben酚,后者在 400nm 有最大吸收峰,
通过测定吸光值升高速率来计算 α-GAL 活性。
自备用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。试剂组成和配制:
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。试剂一:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入 2.5mL 蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂仍-20℃保存。
试剂二:液体 4mL×1 瓶,4℃保存。试剂三:液体 13mL×1 瓶,4℃保存。粗酶液提取:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量
(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 15000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 400nm,蒸馏水调零。2、样本测定(在 EP 管或 96 孔板中依次加入下列试剂):
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 25 | |
蒸馏水 | 25 | |
试剂二 | 35 | 35 |
样本 | 10 | 10 |
试剂三 | 130 | 130 |
相关图片:
α-GAL 活性计算:
- 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
- 按样本蛋白浓度计算:
α-GAL 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T
=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr
- 按样本鲜重计算:
α-GAL 活性(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W
- 按细菌或细胞密度计算:
α-GAL 活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T
=0.08×(ΔA +0.0027)
V 反总:反应体系总体积,0.07mL;V 样:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V 样总: 加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g; 500:细胞或细菌总数,500 万;T:反应时间,30min。
- 用 96 孔板测定的计算公式如下
值。
- 按样本蛋白浓度计算:
α-GAL 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T
=59.83×(ΔA+0.0027) ÷Cpr
- 按样本鲜重计算:
α-GAL 活性(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=59.83×(ΔA+0.0027) ÷W
- 按细菌或细胞密度计算:
α-GAL 活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T
=0.12×(ΔA +0.0027)
V 反总:反应体系总体积,0.07mL;V 样:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V 样总: 加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g; 500:细胞或细菌总数,500 万;T:反应时间,30min。
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