Phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) test kit

微量法 100 管/96 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

PEPC（EC 4.1.1.31）广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中，是催化磷酸烯醇式bing酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸呈不可逆反应的酶，对三羧酸循环的运转起重要调节作用。测定原理：
PEPC 催化磷酸烯醇式bing酮酸和 CO2 生成草酰乙酸和 HPO42-，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH 生成苹果酸和NAD+，在 340nm 测定 NADH 减少速率，计算 PEPC 活性。需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 15 mL×1 瓶， 4℃保存；试剂二：粉剂×2 瓶，-20℃保存；
试剂三：原液 10μL×1 支，4℃保存；试剂三：稀释液 5mL×1 瓶，4℃保存；样本的前处理：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。

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测定步骤和加样表：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、样本测定

取试剂二瓶一瓶，加入 6mL 试剂一和 4.2mL 蒸馏水充分混匀，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；现配现用。
试剂三工作液的配制：将试剂三原液：试剂三稀释液=1μL:329μL 稀释，混匀，用多少配多少。
在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、20μL 试剂三、170μL 试剂二，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 5min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。PEPC 活性计算：

用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）PEPC 活力计算
单位定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPC（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=643×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 PEPC 活力计算

按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

按样本鲜重计算

单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPC（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=643×ΔA÷W

按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。PEPC（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=1.286×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：
比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

用 96 孔板测定的计算公式如下

1、血清（浆）PEPC 活力计算
单位定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPC（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=1286×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 PEPC 活力计算

按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

按样本鲜重计算

单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPC（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=1286×ΔA÷W

按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。PEPC（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=2.572×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：
96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。