增强型miRNA第一链合成试剂盒

保存条件 ：-20℃

供应商 ：LABLEAD

规格 ：25次

产品货号：MF0201
储存温度：-20 ℃
产品组成

组成	体积
E.coli Poly(A) Polymerase(5U/μl)	50U
Labscript Hˉ RTase (200U/μl)	5000 U
2 × miRT Reaction Mix	250 μl
RNase free H2O	1 ml

制品说明
miRNA第一链合成试剂盒本试剂盒采用在Poly(A)加尾法原理，首先miRNA 3’末端加Poly(A)尾，再使用Anchored oligo(dT)-universal tag通用逆转录引物进行逆转录反应，最终生成miRNA对应的cDNA第一链。本试剂盒采用特殊优化预混mix将Poly(A)加尾和反转录合并为一步完成，简化了操作步骤并提高Poly(A)加尾和逆转录效率，该试剂盒具有可从20pg-2ug的total RNA中有效制备miRNA对应的cDNA第一链。一次合成的cDNA可检测多个microRNA，节约了样品和成本。
注：该试剂盒须与miRNA增强型荧光定量检测试剂盒（MR0201）配套使用
操作步骤
一、miRNA3’末端进行Poly (A)加尾和逆转录反应（第一链合成）










1.加入以下试剂至总体积20μl (最后加入E.coli Poly(A) Polymerase 和 Labscript Hˉ RTase）

Components	Volume	Final Concentration
Total RNA	x μl	Up to 2μg
2 × miRT Reaction Mix	10 μl	1 ×
E.coli Poly(A) Polymerase(5U/μl)	0.3-0.4 μl(见注意事项)	2U
Labscript Hˉ RTase (200U/μl)	0.8-1μl (见注意事项)	200U
RNase free H2O to final volume	20 μl

注意事项
1.E.coli Poly(A) Polymerase 和 TRUEscript Hˉ RTase  非常粘稠和微量，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请点甩离心后使用，并且避免吸头外壁沾附损失。E.coli Poly(A) Polymerase可以每次按照0.3μl使用，TRUEscript Hˉ RTase 可以每次按照0.8μl使用，也不影响使用效果。
*在反应中使用的total RNA 必须含有小分子RNA。
*此过程也可以使用小分子RNA， miRNA无法直接用分光光度计定量，建议加入量为2μl ~5μl。可根据目的miRNA丰度决定加入量，但是对于低丰度miRNA 样品而言(如血清血浆提取物)，可直接加入最大体积8 μl。
2.移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在42℃反应60 min。
3.85℃加热5秒钟失活E.coli Poly(A) Polymerase 和 Labscript Hˉ RTase。合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存；也可以直接进行下游PCR或者荧光定量PCR检测。
二、 按照LABLEAD miRNA增强型荧光定量试剂盒(货号：MR0201)进行real time PCR。注：按照上述操作步骤得到的cDNA模板用于下游PCR或者荧光定量PCR检测时，可以根据实际情况选择使用  量，对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA  模板易导致非特异性扩增，可根据所检测miRNA  的丰度适当的稀释cDNA（5-10倍或者100倍）后使用。如果发现有非特异扩增条带，或者融链曲线显示有非特异扩增，往往 提示cDNA模板过量， 可以尝试将上述cDNA模板稀释几十到几百倍甚至上千倍再使用